四种不同品种灵芝的质量研究

赵 慧

天津市河西区口腔医院药剂科(天津 300000)

灵芝为担子菌纲，多孔菌科、灵芝属真菌的总称[1]。《中华人民共和国药典》2015年版收载的灵芝药材是赤芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体[2]。具有补中益气、延年益寿、扶正固本、滋阴强壮等功效[3]。科学研究证实[4]，灵芝多糖类和三萜类是其主要的药理活性成分。《中华人民共和国药典》2015年版中以灵芝多糖含量的高低作为评价灵芝质量的标准之一,日本等国家则以灵芝酸含量的高低来控制灵芝的质量[5]。

近年来随着灵芝在抗肿瘤、免疫调节、降血糖等方面的作用逐步被人们所认识，市场上的灵芝产品日益增多，灵芝保健品、药用产品不断升温，灵芝药材的市场需求量也日益增大，然而,野生灵芝资源有限,人工栽培的灵芝由于产地、栽培技术、采收条件等的差异,导致市场上的灵芝产品良莠不齐，本实验选取了灵芝的道地产区安徽大别山区的两种灵芝以及山东和东北两大人工栽培灵芝的主要产区的灵芝，从灵芝总多糖的含量和灵芝酸类成分HPLC指纹图谱两方面对这几个产地的灵芝的质量进行研究，从而为灵芝原料的采购提供可靠的理论依据。

1 材料与试剂

1.1实验材料本实验所用灵芝分别为安徽大别山松杉灵芝、安徽大别山密纹灵芝、东北赤芝、山东紫芝(采集时间：2018年10月)，经黄崔生教授鉴定均符合药典要求的赤芝和紫芝类。

1.2仪器与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪；UV-1206紫外分光光度计(日本岛津公司)；AEL-200电子天平(xiangxiBanlance factory)；AB204-N分析天平(梅特勒托利多仪器公司)；葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所)；乙腈(色谱级)；磷酸(分析纯)；香草醛(分析纯)；冰醋酸(分析纯)等。

2 方法与结果

2.1灵芝多糖含量测定参照《中国药典》2015年版一部中灵芝多糖的含量测定方法，建立了适合本实验样品的灵芝多糖含量测定方法。本实验采用索氏提取法对灵芝多糖进行提取，蒽酮-硫酸法测定其含量，并对线性、精密度、稳定性、重复性、加样回收进行了考察。

2.1.1 灵芝多糖的含量测定方法 ①对照品溶液的制备。取一定量的葡萄糖对照品105℃干燥至恒重，精密称取10 mg，用重蒸水溶解，定容至100 mL制成0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。②供试品溶液制备。取灵芝药材粉末2 g，精密称定，置索氏提取器中，加水90 mL，移置电热套中，加热回流提取至提取液无色，将提取液转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取提取液10 mL，置250 mL具塞三角瓶中，加入乙醇150 mL，摇匀，4℃放置12 h，取出，离心，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。③含量测定方法。精密吸取供试品溶液2 mL,置10 mL具塞试管中，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1 g,加入80%的硫酸溶液100 mL,使溶解，即得)6 mL，摇匀，置沸水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光法在625 nm处测定吸收值。

2.1.2 灵芝多糖含量测定的方法学考察 ①线性关系的考察。分别精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分别置10 mL具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，摇匀，置沸水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，在625 nm的波长处测定吸收度，以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.004 6x+0.018 1(r=0.999 2)，葡萄糖的加入量在20～120 μg的范围内与吸收度呈良好的线性关系。②精密度试验。分别精密吸取同一葡萄糖对照品溶液(0.1 mg/mL)0.6 mL,依照上述显色方法，重复测定6次，测得吸收值的平均值为：0.323，RSD为：2.00%(n=6)，表明本方法葡萄糖对照品的显色重复性良好。③重复性试验。取同一批灵芝样品6份，60℃干燥后粉碎，精密称取灵芝粉末2 g，按照2.1.1②供试品溶液的制备方法制备供试品，分别吸取供试品溶液0.2 mL,依照上述含量测定方法进行灵芝多糖的含量测定，测得吸收值的平均值为：0.325，RSD值为：1.28%，表明此方法重复性良好。④稳定性试验。精密吸取标准品溶液0.6 mL，依照2.1.1③的含量测定方法显色，分别在显色后5，10，15，20，25，30 min时进行测定，测得的吸收值平均值为：0.324，RSD为:0.57%(n=6),表明该方法稳定性良好。⑤加样回收试验。本方法因无灵芝多糖对照品而以葡萄糖为对照品。多糖提取采用的是水提醇沉法，葡糖糖用乙醇无法使其沉淀，故用葡糖糖对照品溶液直接加入灵芝多糖提取液的办法进行加样回收实验。

精密量取0.2 mL已知含量的灵芝多糖浓缩液9份，分为3组，分别精密加入浓度为0.1 mg/mL的标准葡萄糖对照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,按照上述含量测定方法测定其含量,计算回收率。回收率范围在98.53%～103.58%平均回收率为100.22%，RSD为1.78%，表明此方法回收率符合要求，见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)

2.1.3 不同品种灵芝药材中灵芝多糖含量比较 按照2.1.1③灵芝多糖的含量测定方法对4个产地的灵芝进行灵芝多糖的含量测定，见表2。

表2 不同产地灵芝药材中灵芝多糖的含量比较

2.2不同品种灵芝子实体灵芝酸类成分HPLC指纹图谱

2.2.1 供试品溶液[6]的制备 称取灵芝药材3 g加无水乙醇150 mL热回流提取2 h，过滤，残渣再无水乙醇150 mL回流2 h，共重复提取3次，滤液合并，减压蒸干后加氯仿15 mL溶解，移至分液漏斗中，再用氯仿洗涤残渣2次，合并氯仿液；用饱和碳酸氢钠萃取氯仿4次(15 mL×4)，合并碳酸氢钠液，用6 mol/mL盐酸调节pH 2～3，用氯仿萃取4次(15 mL×4)，合并氯仿液，用水洗涤氯仿液，弃去水层，氯仿液用无水硫酸钠干燥，过滤，用氯仿洗涤无水硫酸钠3次(15 mL×3)，洗涤液与滤液合并，减压蒸干，残渣用甲醇溶解，过微孔滤膜。

2.2.2 色谱条件 流动相:乙腈和水梯度洗脱,梯度洗脱程序见表3;色谱柱:capcellC18柱;检测波长：254 nm;柱温:30℃;进样量：30 μL;流速：0.8 mL/min。

表3 梯度洗脱表

2.2.3 试验结果 4个产地灵芝的灵芝酸HPLC指纹图谱见图1～4。

图1 大别山密纹灵芝

图2 大别山松杉灵芝

图3 东北赤芝

图4 山东紫芝

3 讨论

灵芝多糖具有提高机体免疫力、抗肿瘤、消除体内自由基、降血糖、降血脂等作用[7]，本实验利用蒽酮-硫酸法对灵芝的多糖含量进行测定，其中安徽大别山松杉灵芝多糖含量最高(16.37 mg/g)，其它品种的灵芝多糖含量从高到低依次为：安徽大别山密纹灵芝(15.83 mg/g)，东北赤芝(15.29 mg/g)，山东紫芝(14.96 mg/g)。灵芝三萜在免疫调节和抗肿瘤方面显著效果[4]，其含量的高低直接决定了灵芝产品抑肿瘤效果的好坏。本实验利用HPLC法测定了4个品种灵芝的灵芝酸类成分指纹图谱，实验结果显示4个品种灵芝的灵芝酸类成分指纹图谱具有明显差异。

本实验综合评价了灵芝的药效物质，实验结果表明由于地理气候条件等许多因素的影响，各品种灵芝质量存在差异，该实验结果可为灵芝原料的采购提供可靠的理论依据。