林蛙卵油的提取、成分分析及抗氧化活性研究

韩子晗,孙 尧,杨富雅,高 冷

(长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春 130012)

东北林蛙(RanatemporariachensinensisensisDavid),简称林蛙,又称雪蛤,俗称田鸡、哈士蟆,属两栖纲、无尾目、蛙科、林蛙属,广泛分布于我国中北部,主产于我国黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古。中国林蛙体内富含蛋白质、糖类以及多种维生素和激素等营养成分[1],具有重要的保健功能[2]。林蛙卵是林蛙油生产过程中的副产物之一,林蛙卵的年产量大且未能得到充分利用逐渐得到关注。林蛙卵油中含有丰富的不饱和脂肪酸成分[3-4],林蛙卵油具有抗惊厥[5]、抗焦虑[6]和调节血脂[7]等作用。近几年,国外对于林蛙的研究微乎其微,对于林蛙卵油的研究尚未查阅到相关文献,国内刘俊梅等[8]对林蛙卵的营养成分和保健功效进行了系统分析,陈宁宁等[9]对林蛙卵油进行成分分析,并利用脂肪酸的乳化性质在化妆品领域进行产品研制。

CO2是一种无毒、纯度高、可再循环利用的溶剂,是超临界流体提取技术最常用的溶剂[10-11]。与常见的有机溶剂提取法相比,超临界流体提取物中没有溶剂残留,同时CO2的临界压力与临界温度较为温和,提取过程可以在较低的压力温度下进行,不会对热敏性物质产生影响,更不会引起部分物质的氧化[12]。作为一种环境友好型技术,超临界流体提取被应用于各种科学和工业生产领域[13]。杨小斌等[14]研究了超临界二氧化碳萃取蓝圆鲹鱼油的工艺条件,探究了不同提取条件对蓝圆鲹鱼油提取率的影响;Nuria等[15]使用超临界二氧化碳对鱼油进行提取,并与其它方法进行了比较。

气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用灵敏度较高、抗干扰能力强,在化学、生物领域具有广泛的应用[16-18]。肖井雷等[19]利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的方法,对林蛙油中激素类成分进行了测定。

本文采用超临界CO2提取法从林蛙卵中提取林蛙卵油,以单因素实验为基础,研究不同的提取因素对林蛙卵油提取率的影响,后续进行正交试验设计和极差分析,得出各因素之间的交互作用,确定不同因素对林蛙卵油提取率的影响强弱,对最佳提取工艺进行优化。采用GC-MS对林蛙卵油的成分进行检测分析,鉴定其主要成分,进而对其进行抗氧化活性研究[20-21],为更好地开发并利用林蛙卵油提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

林蛙卵 长春工业大学化学与生命科学实验室;正己烷 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;氢氧化钠、甲醇、乙醚、氢氧化钾、无水乙醇、盐酸、氯化钠 分析纯,北京化工厂;水杨酸、邻苯三酚 分析纯,天津市光复精细化工有限公司;硫酸亚铁 分析纯,廊坊科瑞化工有限公司;过氧化氢 分析纯,西陇化工股份有限公司;Tris(生化试剂) 上海展云化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析纯,合肥巴斯夫生物科技有限公司。

SCION SQ气质联用仪 上海冉超光电科技有限公司;HA221-50-06超临界CO2提取仪 江苏华安科技有限公司;AE1012031紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;CO2钢瓶(40 L) 沈阳鑫东基化工气体有限公司;MixPlus漩涡振荡器 南京东迈科技仪器有限公司;JE101电子天平 上海浦春计量仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 林蛙卵油的提取

1.2.1.1 原料预处理 将林蛙卵除杂后放至超声波清洗仪(40 kHz,30 ℃下超声清洗30 min)中清洗,再进行真空干燥,相对真空度0.09 MPa,温度90 ℃干燥至表面不含水分,使用粉碎机进行粉碎,-20 ℃放置备用。

1.2.1.2 林蛙卵油提取工艺 称取1 kg经过预处理的干燥林蛙卵原料装入提取釜中,加盖拧紧,装入反应容器中,控制单因素实验条件,在一定的温度、一定的压力、一定的时间和一定的CO2流量进行提取,通过收集林蛙卵油,计算提取率,确定最佳单因素范围。

1.2.1.3 单因素实验 a:提取温度对林蛙卵油提取率的影响:称取1 kg预处理过的林蛙卵原料,控制提取时间150 min,提取压力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不变,改变提取温度分别为40、45、50、55、60、65和70 ℃,提取林蛙卵油,研究提取温度对林蛙卵油提取率的影响。

b:提取压力对林蛙卵油提取率的影响:称取1 kg预处理过的林蛙卵原料,控制提取时间150 min,提取温度55 ℃,CO2流量10 L/h恒定不变,改变提取压力分别为15、20、25、30、35、40和45 MPa,提取林蛙卵油,研究提取压力对林蛙卵油提取率的影响。

c:提取时间对林蛙卵油提取率的影响:称取1 kg预处理过的林蛙卵原料,控制提取温度55 ℃,提取压力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不变,改变提取时间分别为60、90、120、150、180、210和240 min,提取林蛙卵油,研究提取时间对林蛙卵油提取率的影响。

d:CO2流量对林蛙卵油提取率的影响:称取1 kg预处理过的林蛙卵原料,控制提取时间150 min,提取温度55 ℃,提取压力30 MPa,改变CO2流量分别为4、6、8、10、12、14和16 L/h,提取林蛙卵油,研究CO2流量对林蛙卵油提取率的影响。

1.2.1.4 正交试验 在单因素实验的基础之上,筛选出对提取率影响较大的因素:提取温度、提取压力、提取时间、CO2流量,并以林蛙卵油提取率为检验指标,进行L9(34)正交试验设计,正交实验设计因素水平表见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平Table 1 Factor and level of Orthogonal test L9(34)

1.2.1.5 林蛙卵油提取率测定方法 使用电子天平称量出干燥林蛙卵的质量,记为m2,使用超临界CO2提取,提取完成称量林蛙卵油质量,记为m1,根据公式计算出林蛙卵油提取率X。林蛙卵油提取率公式为:

式(1)

式中,X:林蛙卵油的提取率(%);m1:林蛙卵油的质量(g);m2:干燥林蛙卵的质量(g)。

1.2.2 脂肪酸组成的检测方法

1.2.2.1 林蛙卵油样品前处理 准确称取提取后的林蛙卵油0.20 g,加入正己烷使林蛙卵油完全溶解并定容在10.00 mL容量瓶中,摇匀后用移液枪移取50 μL于10 mL试管中,加入0.4 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液2.00 mL后,放置在漩涡振荡器中,振荡2 min,放置10 min,再加入1.95 mL正己烷于试管中,将其放入旋涡振荡器振荡2 min,让后用质量分数为8.0%的氯化钠溶液稀释至10 mL,以2000 r/min离心10 min后吸出上清液于微量试管中,过0.45 μm的微孔滤膜过滤,再经过三氟化硼法进行脂肪酸的甲酯化处理[22],最后取1 μL样品进行GC-MS分析。

1.2.2.2 色谱条件 DB-5MS毛细管柱(30 mm×0.25 μm×0.25 nm),进样口温度250 ℃;程序升温:90 ℃持续1 min,以5 ℃/min至140 ℃,再以以3 ℃/min至170 ℃,持续1 min,最后以10 ℃/min至250 ℃,持续5 min。载气:高纯氦气;流量1 mL/min;分流比:40∶1。

1.2.2.3 质谱条件 EI+离子源,离子能量70 eV;灯丝流量0.2 mA;离子源温度:230 ℃;接口温度:250 ℃;扫描质量范围:10～550 amu。

1.2.2.4 图谱分析 GC-MS数据的定性分析:样品经过 GC-MS分析后,以峰的保留时间及谱库检索进行定性分析,然后与相应标准峰面积进行比较完成定量分析得出林蛙卵油主要的化学成份。

1.2.3 抗氧化活性

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的测定 依据贺银菊等[23]的描述,配制1 mmol/L的DPPH溶液,放置在4 ℃冰箱中备用。实验前,用无水乙醇将配制好的溶液稀释至0.2 mmol/L使用。取1～8号试管中分别加入不同浓度的林蛙卵油作为实验组,9号试管作为对照组,依次测定在519 nm处的吸光度值。

DPPH自由基清除率(I,%)公式

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(2)

式中:A0为空白对照组的吸光度值;A1为实验样品组的吸光度值。

1.2.3.2 羟基自由基清除率的测定 采用水杨酸乙醇-分光光度法[24]并做适当改进,测定林蛙卵油对羟基自由基的清除能力,取1～8号为样品组、9号为空白组、10～17号为不加显色剂的对照组。1～8号试管中分别加入1 mL不同浓度的林蛙卵油,再依次加入1 mL的硫酸亚铁溶液、1 mL的乙醇-水杨酸溶液,11 mL去离子水以及1 mL的过氧化氢溶液。向9号管中添加1 mL的硫酸亚铁溶液、1 mL的乙醇-水杨酸溶液,12 mL去离子水以及1 mL的过氧化氢溶液。向10～17号管中分别添加1 mL的硫酸亚铁溶液、1 mL的乙醇-水杨酸溶液,12 mL去离子水以及各浓度的林蛙卵油。水浴15 min后取出,在510 nm处依次测定反应后各溶液吸光度值。

I(%)=[A0-(A1-AX)]/A0×100

式(3)

式中:A0为空白对照组的吸光度值;A1为实验样品组的吸光度值;AX为不加显色剂对照组的吸光度值。

1.2.3.3 超氧阴离子自由基清除率的测定 参考Siswoyo等[25]的方法,取1～8号试管中分别加入2 mL不同浓度的林蛙卵油作为实验组,9号试管中加入2 mL去离子水作为对照组,再加入5.0 mL Tris-HCl缓冲溶液,充分混匀,37 ℃水浴10 min,加入1.0 mL邻苯三酚溶液,充分反应6 min,迅速加入0.5 mL HCl终止反应。依次测定反应后各溶液在420 nm处的吸光度值。

超氧阴离子自由基清除率(I,%)公式:

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(4)

式中:A0为空白对照组的吸光度值;A1为实验样品组的吸光度值。

1.3 数据处理

使用SPSS 16.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 CO2超临界提取条件单因素实验结果

由图1A可以看出,温度低于60 ℃时,提取温度升高使分子间的热运动加剧,传质效率和扩散系数增加,从而增加CO2流体的溶解度,提取率也随之升高。而当温度高于60 ℃时,温度升高,CO2流体的密度降低,导致其溶解能力降低,提取率也随之降低[26]。因此温度选择为55、60、65 ℃。

由图1B可以看出,在提取过程中当压力低于35 MPa时,CO2流体的密度随着压力的升高而增加,不断接近林蛙卵油的密度而发挥CO2的脂溶性,根据相似相溶原理,林蛙卵油在CO2流体中的溶解度不断增加,从而使提取率快速升高。当压力达到35 MPa时,继续升高压力,溶解度基本达到饱和状态,林蛙卵油的溶解量几乎不再增加,提取率增加变缓,甚至不变[27]。因此提取压力选择为30、35、40 MPa。

由图1C可以看出,当提取时间小于150 min时,CO2流体对物料浸提不完全,提取率低,提取时间增加,CO2流体与物料充分接触,使浸提充分,所以能迅速地提高提取率。当提取时间达到150 min后,物料已基本被充分提取,再增加提取时间对提取率影响不大[28]。因此提取时间选择为150、180、210 min。

由图1D可以看出,当CO2流量增大,提取釜入口处的CO2流速增大,提取釜中CO2的流动方向由于卷吸效应发生弯曲,CO2流量越大,卷吸效应越强,使得提取釜中的原料与超临界CO2充分反应,使提取速率不断升高。当CO2流量超过10 L/h时,提取率变化不大。因此CO2流量选择为8、10、12 L/h。

图1 单因素实验结果Fig.1 The result of single factor experiment

根据图1所示的曲线,从量化生产的经济方面考虑,为了提高林蛙卵油的提取率,同时又降低能源损耗,选取提取温度在55～65 ℃,最适提取压力在30～40 MPa之间,最适提取时间在150～210 min之间,最适CO2流量在8～12 L/h之间。

2.2 正交试验结果

在单因素实验的基础上,采用四因素三水平的的正交设计方案,在9种不同工艺条件下提取林蛙卵油,分别测定其提取率,结果见表2。表2的极差分析结果表明,超临界提取4个因素对林蛙卵油提取率的影响顺序为:提取压力>提取温度>CO2流量>提取时间。综合考虑,林蛙卵油的最佳提取方案为A2B2C1D2,即最佳提取工艺条件组合为提取压力35 MPa,提取温度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取时间150 min。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 正交试验最佳提取条件验证

在上述最佳条件下(提取压力35 MPa,提取温度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取时间150 min)进行3次重复试验,其林蛙卵油提取率分别为34.36%、34.18%和34.24%,得到平均提取率为34.26%±0.09%,由提取率可看出,最佳提取工艺条件具有较好的重复性,林蛙卵油提取率较高,说明该工艺条件是合理的、可靠的。

2.4 林蛙卵油成分分析结果

采用GC-MS分析法对CO2超临界提取法所得到的林蛙卵油脂肪酸甲酯液进行分析,得林蛙卵油油脂肪酸甲酯色谱图,如图5所示。同时采用面积归一化法定量分析计算出各成分的相对含量,结果见表3。由表3可知,林蛙卵油中共鉴定出34种脂肪酸,其饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量分别为31.95%、68.05%。十六烷酸为7.65%、十六碳一烯酸为14.66%、十八碳烯酸(油酸)为27.94%、二十碳五烯酸(EPA)为8.85%及二十二碳六烯酸(DHA)为2.32%。

图2 林蛙卵油脂肪酸甲酯色谱图Fig.2 Fatty acids methyl esterschromatogram of Rana chensinensis egg oil

表3 林蛙卵油脂肪酸成分与含量Table 3 Compositions and contents offatty acids in Rana chensinensis egg oil

如图3,VC清除DPPH自由基能力随浓度升高而增加,当VC浓度为0.8 mg/mL后继续提高浓度清除率基本不发生改变;林蛙卵油清除DPPH能力随林蛙卵油浓度增加而增加,当林蛙卵油浓度为1.0 mg/mL后继续提高林蛙卵油浓度清除率上升缓慢。使用SPSS16.0对数据进行分析,得出VC对DPPH自由基清除能力IC50值为0.289 mg/mL,林蛙卵油对DPPH自由基清除能力IC50值为0.897 mg/mL。

图3 林蛙卵油浓度对DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on DPPH free radicals

如图4所示,VC清除羟基自由基能力随浓度升高而增加,当VC浓度为0.8 mg/mL时,清除率达到最大值,后继续提高浓度清除率基本不发生改变;林蛙卵油清除羟基自由基能力随林蛙卵油浓度增加而增加,当林蛙卵油浓度为1.0 mg/mL时继续提高林蛙卵油浓度清除率上升缓慢。使用SPSS16.0对数据进行分析,VC对羟基自由基清除能力IC50值为0.317 mg/mL,林蛙卵油对羟基自由基清除能力IC50值为1.392 mg/mL。

图4 林蛙卵油浓度对羟基自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on hydroxyl free radicals

如图5所示,VC清除超氧阴离子自由基能力随浓度升高而增加,当VC浓度为1.0 mg/mL后继续提高浓度清除率基本不发生改变;林蛙卵油清除超氧阴离子自由基能力随林蛙卵油浓度增加而增加,当林蛙卵油浓度为1.0 mg/mL时继续提高林蛙卵油浓度清除率上升缓慢。使用SPSS16.0对数据进行分析,VC对超氧阴离子自由基清除能力IC50值为0.457 mg/mL,林蛙卵油对超氧阴离子自由基清除能力IC50值为1.687 mg/mL。

图5 林蛙卵油浓度对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on superoxide anion free radicals

通过与吕培霖等[29]研究的红花籽油、樊梓鸾等[30]研究的红松松针精油、梁美融等[31]研究的花椒精油相比,相同浓度的林蛙卵油抗氧化活性更加优良。

3 结论

通过单因素实验和正交试验确定超临界CO2法提取林蛙卵油的最佳提取工艺为:提取压力35 MPa,提取温度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取时间150 min,此时林蛙卵油的提取率为34.26%。在此条件下采用GC-MS分析法对林蛙卵油脂肪酸甲酯液的成分进行检测,确定其含有34种脂肪酸,其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量分别为31.95%和68.05%,主要脂肪酸有十六烷酸、十六碳一烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)。通过抗氧化活性研究试验表明,林蛙卵油对DPPH自由基的IC50值为0.897 mg/mL,对羟基自由基的IC50值为1.392 mg/mL,对超氧阴离子的IC50值为1.687 mg/mL。林蛙卵油具有较强的体外抗氧化活性,在天然抗氧化剂和保健食品中有良好的开发利用价值。