环保酵素特性成份及微生物种类初步研究*

周 伟，陈 轩，蒋 娟，胡雪筠，李占彬，龙云川，胡 菁， 周少奇，2▲

(1贵州科学院，贵州 贵阳 550001；2华南理工大学 环境与能源学院，广东 广州 510006)

0 引言

环保酵素是由厨余(鲜垃圾)、糖和水经自然发酵后产生的棕色液体，是一种由植物蛋白质、矿物质和保幼激素天然合成的有机化合物，一般由一份厨余垃圾、一份红糖以及十份水为混合，装入密封盖口的塑料容器，倒入约占容器60%的体积，经过三个月发酵后形成的活性发酵液。环保酵素富含多种生物酶及大量有益微生物如酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等，以及特定功能菌如纤维素降解菌、耐酸菌、硝化菌等和酶类物质，可抑制环境中的有害微生物类群的繁殖，尤其是病原菌和腐败细菌的生物活动，这些物质具有良好的环境修复功能，同时环保酵素具有家居清洁、净化水体、净化空气、粪便及有机垃圾制肥、改良土壤等良好的环保治理效果。环保酵素的制作简单、成本低廉、能够有效处理厨余垃圾，且环保酵素能应用于农业，作为肥料促进植物的生长，有效减少化学肥料的施用[1-8]。然而，环保酵素在放线菌、霉菌领域的研究资料较少，同时对酵素中促进植物生长的相关生长因子检测工作还鲜有文献报道。

本研究对环保酵素、食用酵素、刺梨酒为研究对象，通过其在促进植物生长方面的作用，测定其细菌、放线菌、霉菌的数量和放线菌的种类，分析放线菌种群结构和酵素中生长因子化学成分及含量，探讨酵素类产品用作植物生长促进剂改良肥料农用的微生物和化学基础。

1 材料和方法

1.1 环保酵素的制备方法

将瓜果皮、红糖和水按1∶1∶8(250 g∶250 g∶2000 L)的比例加入3L广口塑料罐中，密封后混匀，室温(20～25 ℃)自然发酵。在发酵的前两周每天开盖放气一次，在发酵全程每天混匀一次；发酵1年的环保酵素：2018年12月3日制备的环保酵素装瓶保存；食用酵素：符合现行的团体标准《食用植物酵素》T/CBFIA 08003-2017，此次实验用的酵素以刺梨为主原料的食用酵素[9-11]。

1.2 酵素液成分分析方法

环保酵素中各相关阳离子及酸类含量采用离子色谱方法(IC)进行测定：但筛选到的各离子的与生长素的机制尚有待于进一步研究。另外，本研究只是对酵素中吲哚乙酸及铁载体做了定性测定，其产生机理如何，还需进一步进行定量测定。

1.3 培养基及微生物培养方法

真菌数量测定：采用马丁-孟加拉红培养基，以平板表面涂抹法计数。即称取土壤鲜样10 g，在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液，取稀释度为10-1、10-2的土壤悬浮液各50 μL，接种于盛有灭菌的马丁-孟加拉红培养基的培养皿中，用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3个重复，恒温(25 ℃)培养5～7 d，选取每皿菌落数为15～150的1个稀释度统计菌落数，常规方法计数、纯化和保藏，以供后续分析研究[12-14]。

细菌数量测定：采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，以平板表面涂抹法计数。除恒温(28 ℃)培养3 d以外，其他与放线菌的数量测定方法相同，常规方法计数、纯化和保藏，以供后续分析研究。

放线菌数量测定：采用改良高氏一号培养基，以平板表面涂抹法计数。除取稀释度为10-3、10-4的土壤悬浮液各50 μL，接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外，其余与真菌数量测定方法相同。恒温(28 ℃)培养7～10 d，按上述方法统计菌落数并计算放线菌数量。分离培养基：马丁-孟加拉红培养基、改良高氏一号、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基[15]。

纯化及鉴定培养基：改良高氏一号培养基。

细菌及放线菌培养基配制时加入75 mg/L的重铬酸钾，以抑制杂菌，特别是真菌菌丝的生长[16]。

2 结果和分析

2.1 环保酵素的成份分析与测定结果

图1 各实验对象离子含量分析酸类(g/kg)、酸根离子(mg/L)金属离子(mg/kg)Fig.1 Ion content analysis of each experimental object

2.2 环保酵素的微生物种类分析

环保酵素及刺梨和土壤中的微生物群落形态，通过常规检测方式，细菌、霉菌、放线菌通过稀释及各鉴定培养基的培养，同时通过目测比对完成对各放线菌属的鉴定，微生物群落结构见表1和图2。

结果表明：对比土壤中的细菌数量，环保酵素(瓶装)中的放线菌数量达到了2.2×105cfu/mL(g)的数量，其中环保酵素(桶装)放线菌数量为1×105cfu/mL(g)，说明发酵的时间较久的瓶装酵素中的活性细菌物质增长较快，而用瓜果制成的食用酵素中的细菌量级为1×104的量级，食用酵素中的细菌数量较少，其原因为食用酵素中的主要原材料为水果及红糖等的原生细菌的数量较少，其中刺梨酒中的细菌数量为40005cfu/mL(g)，刺梨酒因其酒精浓度达到了25°之上，其中的细菌存活环境较差。环保酵素(瓶装)及环保酵素(桶装)的真菌数量均为100 cfu/mL(g)，与食用酵素及刺梨酒中的真菌数量差距较大，其中环保酵素(瓶装)放线菌数为1.2×105(cfu/mL(g))而(桶装)放线菌数量为5600(cfu/mL(g))，其中瓶装放线菌内，放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌体为裂片段繁殖，其在储存容器中的繁殖速度较快。

表1 各实验对象微生物群落结构分析Tab.1 Microbial community structure of each experimental object

图2 各实验对象微生物群落结构培养图Fig.2 Microbial community structure of each experimental object

2.3 环保酵素中促生长因子的测定结果

吲哚乙酸系天然植物生长素中在植物界分布最广的，作为确定植物生长素类的作用效价的基准物质。此物质在大肠杆菌等多数的细菌或一种根霉(Rhizopus su-inus)、酵母、玉米黑粉病菌等真菌类中能合成[17]。

铁载体(siderophore)是微生物产生的一种对Fe3+具有超强络合力的低分子量有机化合物，多为八面体构型。其生物合成受外界Fe3+含量影响，可在细胞内进行精细调节。铁载体主要存在于微生物中(细菌、真菌)，此外禾本科植物，如大麦、小麦等，也可以合成铁载体[18-20]。微生物需要铁元素合成细胞色素和酶类，但产铁载体根际菌能促进植物生长发育、增加作物产量、提高植物的抗逆性以及抑制根际有害菌群等作用。环保酵素原液中促生长因子的存在如图3所示。

图3 各实验对象中促生长因子检测图Fig.3 Growth factors in each experimental object

环保酵素(瓶装)、环保酵素、食用酵素、刺梨酒中的吲哚乙酸含量分别为26 mg/L、28.7 mg/L、26.9 mg/L、34.9 mg/L，其中刺梨酒中的吲哚乙酸含量最高，其原因为刺梨原材料中生长素的含量较高，各酵素中的吲哚乙酸含量差别不大，酵素较玉米发酵液中的(IAA)含量(4 mg/L)高，其中各实验样品均达到了生物菌肥(2.5～50 mg/L)的范围，说明其对植物的生长发育及增加作物产量有着明显的作用。环保酵素(瓶装)、环保酵素、食用酵素、刺梨酒中的铁载体含量分别为26 mg/L、28.7 mg/L、26.9 mg/L、34.9 mg/L，刺梨酒中的铁载体含量较高，主要为刺梨植株植物体内合成，三种酵素的平均铁载体含量为27.2 mg/L，铁载体含量较高，其来源为产铁载体细菌及相关代谢过程。

3 讨论

由于环保酵素是成本低廉、简易可行的绿色村庄有机垃圾生物处理方式。农村厨余垃圾制成环保酵素，以及特定功能菌如纤维素降解菌、耐酸菌、硝化菌等和酶类物质，具有广阔的应用前景。本文针对环保酵素的微生物群落种类及数量进行了分析，放线菌菌落主要为链霉菌属及假单胞杆菌属，其中环保酵素(瓶装)放线菌数量均达到了105数量级，其中的真菌较刺梨酒和土壤中培养的数量少，环保酵素和食用酵素放线菌数量均达到了105数量级，说明环保酵素中微生物形态多样性丰富及数量较多。同时本文也对样品中的生长素含量进行了检测，检测的生长素分别为吲哚乙酸和铁载体，各酵素中的吲哚乙酸含量差别不大，酵素较玉米发酵液中的(IAA)含量高，其中各实验样品均达到了生物菌肥(2.5～50 mg/L)的范围，三种酵素的平均铁载体含量为27.2 mg/L，铁载体含量较高，其来源为产铁载体细菌及相关代谢过程。环保酵素中各离子及酸根离子含量测定结果表明刺梨酒中的吲哚乙酸含量最高，金属离子(钾、钠、钙、镁)均超过了100 mg/kg。