二至丸对去卵巢所致AD 小鼠学习记忆功能的影响*

★ 周茂福 黄丽萍 刘超 侯敏 燕波 官扬 谢永艳 彭杨鹏 陈耀辉

（1.江西中医药大学 南昌 330004；2.江西中医药大学科技学院 南昌 330004；3.江西省人民医院肾内科 南昌 330006）

阿尔茨海默病（alzheimer's disease， AD）是进行性记忆和认知功能障碍为特征的神经退行疾病，其主要病理变化表现有胆碱神经元缺失、细胞外Aβ 沉积和细胞内高度磷酸化Tau 蛋白形成。AD发病率逐年增高，但目前尚无特效防治药物。越来越多的资料证明，AD 的发生与雌激素水平低下密切相关。流行病学数据显示，女性绝经后AD 的发病率是同龄男性的1.5～3 倍［1-2］，并且伴随着绝经后雌激素的减少痴呆的发生率越高。临床上雌激素替代疗法能显著改善绝经期妇女AD 的相关症状［3］，但会给患者增加患肿瘤的风险，从天然药物中寻找有效的AD 防治药物是目前研究的热点。

“肾主智”，肾虚是AD 发生内在机理，女性绝经期前后，天癸将竭，肾精日衰，冲任二脉逐渐亏虚，雌激素分泌不足，脑髓失养，发为痴呆。二至丸由女贞子、墨旱莲二味中药组成，功能补肝肾、益精血之功效。现代药理研究表明，二至丸可改善D-半乳糖致衰老模型大鼠学习记忆能力，具有清除脑自由基、抗衰老和神经元保护等作用［4］。但二至丸能否能改善雌激素缺乏所致AD 动物的认知能力？目前未有研究。因此，观察二至丸对雌激素低下AD 动物学习记忆能力的影响，将为临床应用二至丸防治AD 的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 二至丸，江西中医药大学自制，批号：20150803，规格：48g/瓶。用研钵研磨并用双蒸水配成二至丸高剂量0.2g/mL、低剂量0.1g/mL混悬液。苯甲酸雌二醇购自宁波市三生药业有限公司，批号：S141201，用芝麻油稀释至0.2mg/mL。

1.2 动 物 昆 明 种 雌 性SPF 级 小 鼠，70 只，22～28g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2013-0004。

1.3 试剂 HE 染色试剂盒、尼氏体染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号分别是20160810、20160726）；免疫组化试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号为：40113）；Aβ1-40 抗体（艾博抗贸易有限公司，批号：GR91656-16）。

1.4 仪器 Y 迷宫、八臂迷宫（荷兰noldus 公司）；分析天平（梅特勒公司）；石蜡切片机（Lecia 公司）；显微镜（Lecia 公司）。

1.5 方法

1.5.1 造模、分组与给药 小鼠适应性饲养一周后，摘除卵巢：先用1%戊巴比妥钠溶液50mg/kg腹腔注射麻醉，末肋骨下皮常规皮肤消毒，手术剪纵向切开皮肤，钝性分离肌肉，找出卵巢并结扎卵巢下输卵管，切除脂肪包裹的两侧卵巢。假手术组小鼠仅除去卵巢周围的部分脂肪。手术一周后，对去卵巢小鼠进行阴道上皮脱落细胞涂片检查，取角化细胞持续5d 阴性者为实验用。去卵巢小鼠随机分为4 组：即模型组、阳性对照组（雌二醇）、二至丸高剂量组、二至丸低剂量组，每组14 只小鼠，另设14 只为假手术组。术后6 周后开始灌胃给药，模型组、假手术组用灌胃双蒸水，二至丸高低剂量组分别灌胃给予2.0g 生药/Kg、1.0g 生药/kg，给药容量为1.0mL/100g，阳性对照组小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1mL/只，隔天注射1 次，连续32d。

1.5.2 二至丸对去卵巢AD 小鼠学习记忆的影响 在给药25d 后，用Y 迷宫和八臂迷宫检测小鼠的学习记忆能力。

1.5.2.1 Y 迷宫实验 装置由三个成120°夹角的臂组成，即迷宫的A、B、C 三个臂。每臂长50cm，高15cm，宽6cm。实验时将小鼠从A 臂末端放入，让其在三个臂中自由的出入。然后记录5min 内小鼠进入三个臂的顺序，接着统计小鼠进入各个臂的总次数N 以及计算自发交替反应率C。一次正确的自发交替反应是连续进入三个不同的臂，它反映了小鼠的记忆能力，其计算公式为：C=正确交替反应/（N-2） ×l00%。

1.5.2.2 八臂迷宫实验 实验前2d 小鼠禁食不禁水，体重下降15%～20%。并进行连续2 天的适应性训练，检测记忆实验开始时，只在迷宫的1、3、5、7 放射臂头端放入饲料，将小鼠放入八臂迷宫的中心区，先用一个不透明的盒子将其罩住，5s 后移去，记录检测以下指标：①小鼠找到1、3、5、7 臂头内食物所需的总时间。②错误总数，即小鼠出现错误的总次数，每重复进入已吃过饵的臂1 次记为1次错误。③首错前正确数，即首次错误出现前连续走完正确的臂数。注意在1、3、5、7 臂外相应位置放一些标志物，保证在实验的过程中标志物位置和周围环境不变，同时整个实验过程都要在安静状态下进行，防止噪音对实验结果的影响。

1.5.3 二至丸对去卵巢AD 小鼠海马神经元影响小鼠1%戊巴比妥钠50mg/kg 腹腔注射麻醉，PBS 心脏灌流冲洗，4%多聚甲醛灌流进行体内组织固定，取出海马组织。在4%甲醛溶液中进行固定24h，梯度脱水二甲苯透明后用石蜡加以包埋、切片，切片厚度为4μm，按试剂盒说明进行HE 染色、尼氏染色，观察海马神经元的细胞形态；光镜下每张切片计数3 个视野（400×）的细胞，总和除以3，作为该鼠的海马细胞计数［5］，衡量海马神经元丢失情况。

1.5.4 二至丸对去卵巢AD 小鼠海马CA1 区Aβ 表达的影响 取右脑标本常规石蜡包埋，切片，免疫组化染色观察海马CA1 区Aβ 阳性细胞的表达，并按2.4 法进行计数。

2 结果

2.1 二至丸对去卵巢AD 小鼠学习记忆的影响

2.1.1 Y 迷宫实验结果 结果见表1。与假手术组比较，模型组小鼠正确交替率明显较低（P＜0.05），与模型组比较，经二至丸给药干预后低剂量组小鼠正确交替率明显提高（P＜0.05），高剂量组和阳性组正确交替率有提高但无明显统计学差异。

表1 二至丸对AD小鼠Y迷宫正确交替率的影响（，n=14）

表1 二至丸对AD小鼠Y迷宫正确交替率的影响（，n=14）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别 剂量 正确交替率/%假手术组 - 0.67±0.13*模型组 - 0.55±0.09阳性对照组 0.5mg·kg-1 0.66±0.15二至丸高剂量组 2 g·kg-1 0.63±0.12二至丸低剂量组 1 g·kg-1 0.66±0.09*

图1 海马形态学观察（HE染色，×400）

2.1.2 八臂迷宫实验结果 结果见表2。与假手术组相对比，模型组小鼠进入1、3、5、7 号臂（有效臂）所需的总时间、总错误次数明显上升，首错前正确数降低；与模型组相对比，二至丸高、低剂量组小鼠进入1、3、5、7 号臂所需的总时间与总错误次数明显下降，首错前正确升高。阳性对照药雌二醇组小鼠进入有效臂总时间也有缩短少，但不具有统计学差异。

2.2 二至丸对去卵巢AD 小鼠海马神经元影响 结果见图1-2 及表3-4。HE 染色见假手术组小鼠海马CA1 区神经元呈圆形或者椭圆形，细胞形态整齐、无破损，核仁清晰，神经元细胞数量较多；与假手术组对比，模型组海马CA1 区神经元丢失对比严重，细胞排列稀疏，细胞核染色较深，核固缩较严重，神经元细胞数量较少；与模型组比照，二至丸高、低剂量组和阳性药物组海马CA1 区神经元数量比模型组多，形态比较完整，排列比较整齐，核仁较少发生固缩现象。

尼氏染色见假手术组海马CA1 区神经元细胞密集，胞浆内含有丰富的尼氏小体，甲苯胺蓝染色较深，尼氏体数量较多；与假手术相比，模型组小鼠CA1 区神经元细胞排列疏松，神经元丢失以及核固缩严重，尼氏小体随神经元的丢失而减少；与模型组比较，二至丸高、低剂量组和阳性药物组神经元细胞较为完整，尼氏小体染色较深且数量明显增加，但与假手术组比较，尼氏小体染色较浅。

图2 海马CA1区形态学观察（尼氏染色，×200）

表2 二至丸对AD小鼠八臂迷宫总时间、错误总数、首错前正确数（，n=14）

表2 二至丸对AD小鼠八臂迷宫总时间、错误总数、首错前正确数（，n=14）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别 剂量 进入有效臂所用时间/s 错误总数/次 首错前正确数/次假手术组 - 56.33±35.92* 3.2±0.94* 2.3±0.79*模型组 - 169.40±79.28 4.8±1.33 1.33±0.49阳性对照组 0.5mg·kg-1 105.89±86.09 3.3±1.05* 1.7±0.67二至丸高剂量组 2g·kg-1 49.26±32.91* 3.1±0.74* 2.0±0.66*二至丸低剂量组 1g·kg-1 63.79±46.47* 3.6±1.19* 1.7±0.72

表3 二至丸对去卵巢AD小鼠CA1区细胞的影响（，n=3，HE染色）

表3 二至丸对去卵巢AD小鼠CA1区细胞的影响（，n=3，HE染色）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量 细胞总个数/个 坏死细胞个数/个 细胞坏死率/%假手术组 - 52.67±5.03** 3.67±3.05** 7.23±0.06**模型组 - 41.33±4.04 31.33±8.32 75.01±0.13二至丸高剂量组 2g·kg-1 49.67±4.51* 7.33±2.53** 14.74±0.02**二至丸低剂量组 1g·kg-1 47.33±3.05* 8.33±3.78** 17.78±0.09**阳性对照组 0.5mg·kg-1 48.33±3.52* 7.00±2.01** 14.44±0.04**

表3 二至丸对去卵巢AD小鼠CA1区细胞的影响（，n=3，尼氏染色）

表3 二至丸对去卵巢AD小鼠CA1区细胞的影响（，n=3，尼氏染色）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量 尼式体个数/个假手术组 - 47.33±7.05**模型组 - 8.67±1.53二至丸高剂量组 2g·kg-1 40.67±5.51**二至丸低剂量组 1g·kg-1 39.67±5.03**阳性对照组 0.5mg·kg-1 36.67±8.08**

2.3 二至丸对去卵巢AD 小鼠海马CA1 区Aβ 表达的影响 结果见图3 和表5。假手术组海马CA1区见少量Aβ 阳性细胞，胞浆和突起着色较浅；与假手术组比较，模型组Aβ 阳性细胞数量显著增多，胞浆和突起着色较深，部分聚集在一起；与模型组比较二至丸高、低剂量组、阳性药物组阳性细胞数显著减少，胞浆和突起着色较浅。但在海马区各组均未发现老年斑。

图3 海马CA1区Aβ表达（免疫组化，×200）

表5 二至丸对去卵巢AD小鼠CA1区细胞Aβ阳性细胞表达的影响（n=3）

3 讨论

流行病学数据显示，围经期女性存在较高的痴呆患病率，而且伴随着绝经后雌激素的减少痴呆的发生率越高［1］。雌激素对于AD 有积极的影响，雌激素能够促进脑内神经细胞轴突、树突的生长、突触的形成，雌激素可促进长时程增强而促进学习记忆， 雌激素具有抗兴奋性氨基酸毒性、增加大脑皮质血流量和提高大脑葡萄糖的利用率， 雌激素可减少神经细胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ 片段的产生等［6-7］。去卵巢所致动物模型和雌激素信号通路常用于老年痴呆的发病机制及抗老年性痴呆药物的药效与机制研究［8］。

本次试验结果表明，与假手术组小鼠比较，模型组小鼠在八臂迷宫实验中其进入有效臂所用时间、总错误次数显著上升，首错前正确数明显降低性延长，且在Y 迷宫实验中正确交替率明显减少；形态学显示细胞总数显著减少，坏死细胞数显著增加，细胞坏死率显著升高，且尼氏小体随神经元的丢失而减少；CA1 区Aβ 蛋白表达增加，表明去卵巢所致学习记忆障碍小鼠造模成功.与模型组相比，二至丸高、低剂量组小鼠进入有效臂所需的总时间明显下降，且小鼠正确交替率明显提高（P＜0.05）。在形态学观察中，经二至丸给药干预后的小鼠，在海马CA1 区神经元形态比较完整，排列比较整齐，核仁较少发生固缩现象，神经元细胞较为完整且尼式体数量较多。Aβ 免疫组化实验结果显示二至丸高、低剂量组Aβ 阳性细胞数显著减少，胞浆和突起着色较浅。以上结果提示二至丸能够改善去卵巢AD 小鼠的学习记忆能力，可能与其神经元保护作用和减少Aβ 沉积有关。其作用机制还待进一步研究发现。