生肌愈疡膏的质量标准研究

★ 李佳莉 朱卫丰* 唐丽萍 刘星晔 刘水婷

（1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004；2.江西省中医院药剂科 南昌 330006）

生肌愈疡膏是江西中医药大学附属医院皮肤外科的临床经验方，主要用于治疗压疮、体表溃疡。由当归、白芷、紫草、血竭等药材经麻油熬制后加入白蜡制成。具有解毒敛疮、养血活血、祛腐生肌［1-2］的功效。为控制其质量，保证患者用药安全，参照国家食品药品监督管理总局令第20 号-《医疗机构制剂注册管理办法》以及《江西省医疗机构制剂注册管理实施细则》建立生肌愈疡膏的质量标准。制定了当归、紫草、血竭的薄层色谱（TLC）鉴别与血竭素的含量测定方法，并按照中药质量标准分析方法验证指导原则对所制定的方法进行验证［3-5］。

1 仪器与试药

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；AP5001N 电子

天平（上海菁海仪器有限公司）；SZ-97A 型自动三重水蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CW-80A 型漩涡混匀器（上海青浦沪西仪器厂）；EAELA 旋转蒸发仪（N-1001 上海爱朗仪器有限公司）；KQ-250VDB 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；薄层层析硅胶G 板（青岛海洋化工厂分厂）；阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614）、藁本内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111737-201507）、血竭高氯酸盐对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110811-201707）；当归对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120927-201315）、紫草（新疆紫草）对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121430-201504）、血竭对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120906-201611）；生肌愈疡膏样品（批号：20190413、20190414、20190415）及相应阴性样品均由现代中药制剂教育部重点实验室提供；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱条件的考察 采用单因素试验确定最佳点样量、温湿度，以获得较理想的薄层鉴别条件。

2.1.1 当归

2.1.1.1 阿魏酸

2.1.1.1.1 点样量的考察 取当归对照药材0.6g 加80℃热水80mL，密塞，振摇5min 后，80℃水浴30min，再振摇5min，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。分别吸取1μL、4μL、6μL、8μL 点于同一块硅胶G 薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视，以4μL 点样量的斑点清晰、圆整且不拖尾，故定点样量为4μL，见图1。

图1 阿魏酸对照药材的TLC图谱

2.1.1.1.2 不同展开温湿度的考察 取当归对照药材溶液、阿魏酸对照品溶液、当归供试品、当归阴性对照品溶液各4μL 根据“2.2.1.1”项下条件及方法分别点于硅胶G 薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）为展开系统，分别在RT：14 ℃、RH：88%和RT：31 ℃、RH：61%两种温湿度条件下展开。结果表明，展开温湿度对展开效果影响不大，各斑点均能有效分开，见图2。

图2 阿魏酸的TLC图谱

2.1.1.2 藁本内酯

2.1.1.2.1 点样量的考察 取当归对照药材0.5g 加甲醇60mL，密塞，超声15min，冰浴1h 后，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。分别吸取1μL、3μL、6μL、10μL 点于同一块硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视，以3μL 点样量的斑点清晰、圆整且不拖尾，故定点样量为3μL，见图3。

图3 藁本内酯对照药材的TLC图谱

2.1.1.2.2 不同展开温湿度的考察 取当归对照药材溶液、藁本内酯对照品溶液、当归供试品、当归阴性对照品溶液各3μL 根据“2.2.1.2”项下条件及方法分别点于硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开系统，分别在RT：20℃、RH：82%和RT：32℃、RH：56%两种温湿度条件下展开。结果表明，展开温湿度对展开效果影响不大，各斑点均能有效分开，见图4。

图4 藁本内酯的TLC图谱

2.1.2 紫草

2.1.2.1 点样量的考察 取紫草对照药材0.25g，用1%的NaOH 溶液振摇提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加盐酸，使液面浮有红色油状物，加乙醚80mL，振摇提取，分取乙醚液，挥干，残渣加无水乙醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。分别 吸 取1μL、3μL、6μL、10μL 点 于 同 一 块 硅胶G 薄层板上，以石油醚- 乙酸乙酯- 冰醋酸（17∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以10%氢氧化钠甲醇溶液，日光下检视，以1μL点样量的斑点清晰、圆整且不拖尾，故定点样量为1μL，见图5。

图5 紫草对照药材的TLC图谱

2.1.2.2 不同展开温湿度的考察 取紫草对照药材溶液、左旋紫草对照品溶液、紫草供试品、紫草阴性对照品溶液各1μL 根据“2.2.2”项下条件及方法分别点于硅胶G 薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）为展开系统，分别在RT：22℃、RH：80%和RT：32℃、RH：56%两种温湿度条件下展开。结果表明，展开温湿度对展开效果影响不大，各斑点均能有效分开，见图6。

图6 紫草的TLC图谱

2.1.3 血竭

2.1.3.1 点样量的考察 取血竭对照药材0.2g，加甲醇10mL，密塞，超声15min，冰浴1h 后，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。分别吸取1μL、3μL、6μL、10μL 点于同一块硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视，以1μL 点样量的斑点清晰、圆整且不拖尾，故定点样量为1μL，见图7。

图7 血竭对照药材的TLC图谱

2.1.3.2 不同展开温湿度的考察 取血竭对照药材溶液、血竭高氯酸盐对照品溶液、血竭供试品、血竭阴性对照品溶液各1μL 根据“2.2.3”项下条件及方法分别点于硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开系统，分别在RT：20℃、RH：82%和RT：31℃、RH：60%两种温湿度条件下展开。结果表明，展开温湿度对展开效果影响不大，各斑点均能有效分开，见图8。

图8 血竭的TLC图谱

2.2 薄层鉴别

2.2.1 当归

2.2.1.1 阿魏酸 取生肌愈疡膏20g，加80℃热水80mL，密塞，振摇5min 后，80℃水浴30min，再振摇5min，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材0.6g 加80℃热水80mL，密塞，振摇5min 后，80℃水浴30min，再振摇 5min，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为对照药材溶液；另取阿魏酸对照品，加甲醇制成1mg/mL 的对照品溶液；再取不含当归的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照TLC 法［6］试验，吸取上述4 种溶液各4μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同的荧光斑点；阴性对照无干扰。阿魏酸的TLC 图谱见图9。

图9 阿魏酸的TLC图谱

2.2.1.2 藁本内酯 取生肌愈疡膏10g，加甲醇 60mL，密塞，超声15min，冰浴1h 后，过滤，蒸干，残渣加甲醇 1mL 使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材0.5g 加甲醇 60mL，密塞，超声15min，冰浴1h 后，过滤，蒸干，残渣加甲醇 1mL 使溶解，作为对照药材溶液；另取藁本内酯对照品，加甲醇制成1mg/mL 的对照品溶液；再取不含当归的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照TLC 法［6］试验，吸取上述4 种溶液各3μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同的荧光斑点；阴性对照无干扰。藁本内酯的TLC 图谱见图10。

图10 藁本内酯的TLC图谱

2.2.2 紫草 取生肌愈疡膏10g，加石油醚（60～90℃）80mL 使溶解，用1%的NaOH 溶液振摇提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加盐酸，使液面浮有红色油状物，加乙醚80mL，振摇提取，分取乙醚液，挥干，残渣加无水乙醇1mL 使溶解，作为供试品溶液；另取紫草对照药材0.25g，用1%的NaOH 溶液振摇提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加盐酸，使液面浮有红色油状物，加乙醚80mL，振摇提取，分取乙醚液，挥干，残渣加无水乙醇1mL 使溶解，作为对照药材溶液；另取左旋紫草素对照品，加无水乙醇制成0.2mg/mL 的对照品溶液；再取不含紫草的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照TLC 法［6］试验，吸取上述4 种溶液各1μL，分别点于同一块硅胶G 薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以10%氢氧化钠甲醇溶液，日光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同的红色斑点，喷显色剂后斑点呈蓝色，阴性对照无干扰。紫草的TLC 图谱见图11。

图11 紫草的TLC图谱

2.2.3 血竭 取生肌愈疡膏10g，加甲醇60mL，密塞，超声15min，冰浴1h 后，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为供试品溶液；另取血竭对照药材0.2g，加甲醇10mL，密塞，超声15min，冰浴1h后，过滤，蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解，作为对照药材溶液；另取血竭高氯酸盐对照品，加3%磷酸甲醇制成0.2mg/mL 的对照品溶液；再取不含血竭的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照TLC法［6］试验，吸取上述4 种溶液各1μL，分别点于同一块硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同橙色斑点；阴性对照无干扰。血竭的TLC 见图12。

图12 血竭的TLC

2.3 含量测定

2.3.1 血竭素

2.3.1.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05moL/L磷酸二氢钠（35∶65）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：440nm；进样量：10μL。

2.3.1.2 溶液的制备 （1）对照品溶液：精密称取血竭素高氯酸盐对照品，置10mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并定容，摇匀，作为血竭素高氯酸盐对照品母液储备液。取血竭素高氯酸盐储备液5mL 至10mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，制成血竭素浓度为36.31μg/mL 的对照品溶液（按血竭素计算，血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377）。（2）供试品溶液：取样品5.0g，精密称定，加入硅藻土10.0g，研匀，置具塞锥形瓶中，精密量取3%磷酸甲醇50mL 加入，称定重量，超声15min，避光，静置5h后，称定重量，用3%磷酸甲醇补足减失重量，摇匀，取上清液滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.3.1.3 专属性试验 取处方中除血竭外的其他成分，按照生肌愈疡膏的制法制成不含血竭的阴性样品，按照“2.3.1.2”项下供试品制备方法处理得阴性对照品溶液，色谱图见图13。

图13 血竭素高效液相色谱图

2.3.1.4 线性关系考察 精密称取血竭素高氯酸盐对照品母液储备液，加甲醇稀释浓度为145.24μg/mL、72.62μg/mL、36.31μg/mL、18.16μg/mL、9.08μg/mL、4.54μg/mL 的对照品溶液，注入液相色谱仪。按“2.3.1.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品浓度（C）为横坐标，峰面积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A=10.547C - 1.97227，r=0.999 9（n=6），结果表明，血竭素检测浓度在4.54μg/mL～145.24μg/mL 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.1.5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液（72.62μg/mL）的对照品溶液10μL，重复进样测定6 次，测定峰面积。结果表明，血竭素RSD=0.17%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号20190413），分 别 于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h 进样，测定。结果，RSD=2.76%（n=8），表明供试品在24h 内稳定。

2.3.1.7 重现性试验 取生肌愈疡膏（批号20190413）6 份，每份5g，按“2.2.3.1” 项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定。结果，血竭素的平均含量为0.28mg/g，RSD=3.83%（n=6），表明方法重现性良好。

2.3.1.8 回收率试验 称取已知含量的生肌愈疡膏2g（批号20190413），共6 份，精密称定，分别加入36.31μg/mL 浓度的对照品溶液，其余按“2.3.1.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，计算回收率，见表1。

表1 加样回发试验结果（n=6）

2.3.2 含量测定 取3 批生肌愈疡膏（20190413、20190414、20190415），按“2.3.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.3.1.1”项色谱条件进行测定。结果3 批样品中血竭素的含量分别为0.277，0.281，0.282mg/g。

3 讨论

3.1 当归质量控制指标的选择 当归作为该制剂中处方量最大的药物，具有阿魏酸和藁本内酯两大药效成分，这两成分极性完全相反，在同一薄层板中显色，对提取方式和展开剂的要求较为苛刻，本研究对两成分分开鉴别的方式进行了探索；考察了甲醇、乙醇和水分别作为提取溶剂的薄层斑点效果，结果发现阿魏酸采用热水水浴提取、藁本内酯采用甲醇超声提取，效果较好；参考药典中对当归的定性鉴别给出的正己烷-乙酸乙酯（4∶1），环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）两个展开系统，经试验环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）对阿魏酸展开效果较好，而藁本内酯采用正己烷-乙酸乙酯（4∶1）层析，斑点清晰不受油性成分影响，展距合适。

3.2 紫草质量控制指标的选择［7-8］在进行紫草薄层鉴别时，分别比较了药典给出的环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）和文献中的石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）两个展开系统的薄层效果，结果显示，紫草素使用前者作为其展开剂时，紫草素上方斑点纵向扩散较严重，采用后者作为展开剂，可大大减轻其扩散程度。

3.3 当归和血竭质量控制指标的选择 当归和血竭药材的鉴别中，供试品的制备方式采用了冰浴，该步骤可以促使部分油性基质白蜡析出，通过过滤将其与供试液分开，可减少跑板时油性物质对斑点形状的影响；在确定血竭的薄层鉴别方法过程中，曾采用乙醇作为提取溶剂，薄层结果中得到的样品斑点受油脂成分的影响中部凹陷。而甲醇作为提取溶剂，薄层斑点清晰，不受其他成分的影响。

3.4 制备供试品时分散剂的选择 根据相关文献报道［9-10］，硅藻土作为油脂性基质软膏的分散剂，具有吸附与利于解吸附的作用，不至于明显改变制剂的酸碱性，避免酸碱性的改变对某些成分溶解能力的影响。因此，本实验采用硅藻土作为生肌愈疡膏的分散剂，提高溶剂的接触面积，有利于提取。