圈养雌性红猩猩发情期粪便中性激素水平的检测方法

●卜海侠 徐晓娟 陈 蓉（南京红山森林动物园 江苏 南京 210028）

红猩猩在动物分类上隶属脊索动物门哺乳纲灵长目猩猩科红猩猩属，为IUCN濒危物种，如今红猩猩仅生活在婆罗洲岛一些零星的区域及苏门答腊岛的最北端。截止到2018 年12 月31 日，中国动物园协会统计中国总计饲养35 只红猩猩（20 只雄性15只雌性），分别饲养于13 个不同的单位，且不易繁殖，关于红猩猩激素水平的研究未见报道。雌二醇（estradiol）是雌激素的一种，亦称“动情素”“求偶素”，有 和 两种类型，雌二醇在雌激素中含量最多，活性也最强，是由卵巢内卵泡的颗料细胞分泌的。孕酮是雌性正常排卵后期黄体所产生的一种孕激素，主要由颗粒细胞产生，在人类和其他动物体内均可以检测到。雌性动物排卵期孕酮主要来自于卵巢，其主要作用是使子宫内膜由增殖期进入分泌期；孕早期妊娠黄体产生大量孕酮；而孕后期则是由滋养细胞产生大量孕酮，给胎儿的早期生长及发育提供支持和保障，使妊娠得以维持，同时能够对子宫起到一定的镇定作用。通过测定1 只圈养雌性红猩猩粪便中的雌二醇和孕酮水平，结合日常观察记录该雌性红猩猩的发情状况，了解其激素变化情况，作为该雌性红猩猩是否怀孕的判定依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

该圈养雌性红猩猩21 岁，出生于菲律宾，2012年7 月引进到上海动物园，自2015 年6 月上海动物园与南京红山森林动物园进行合作，将该雌性红猩猩与南京红山森林动物园的1 只雄性红猩猩进行合笼配对，促其繁殖，雌性红猩猩与其配偶相处融洽，日常行为较为正常，每月均有发情现象，但成功合笼两年却一直未孕。

1.2 试验用品

estradiol-17 和Estadiol检测酶标试剂盒购自ARBOR ASSAYS公司。BIO酶标仪购自基因公司。

1.3 粪样采集

每天上午8:30 定时采集该雌性红猩猩最新排出的粪便，放入自封袋中，标记个体、日期等信息后，置于 20℃的冰箱冷冻待检。共采集99 份粪便样本，时间跨度为216d，早中期为每天采集1 次，后期平均3d采集1 次。

1.4 激素提取

将冷冻粪便烘干，取0.2g于2mL离心管中，添加2mL乙酸乙酯，剧烈摇晃30min，5 000rpm离心15min，取400L上清液置于新的EP管中。在氮气下降、上清液蒸发后，用100L乙醇抽提雌二醇和孕酮。

1.5 激素测定和数据分析

按ELISA说明，制备标准品和空白对照。所有标准品、空白对照和样本均按要求做2 次重复。通过紫外光谱450nm下进行OD（光密度）的测量。

1.6 数据分析

首先根据标准品数值制备标准曲线，其标准曲线符合正态分布。所有样本取平均值后代入标准曲线，用OD值换算出激素浓度。每种激素均用5 块测试板进行检测，每块测试板的变异系数（CV）小于0.5%，从而确保实验操作的稳定性。利用Excel、SPSS13.0 软件整理分析，用配对t检验该雌性红猩猩粪便中性激素的月间差异，并分析其粪便中雌二醇和孕酮水平的相关性，从而推算雌性红猩猩的性周期。

2 试验结果

2.1 交配记录

饲养员根据该雌性红猩猩的交配表现进行记录，交配时间分别为3 月6 日、4 月8 日、5 月9 日、6 月10 日、7 月12 日、8 月14 日、9 月16 日、10月18 日、11 月20 日和12 月22 日。根据交配记录，推算出该雌性红猩猩的月经周期基本维持在31d左右。

2.2 雌二醇的测定

经测定，该雌性红猩猩雌二醇的变化区间在0.00134～0.71679g/g DW（干粪便）。216d共监测到6 个月经周期，分别为34d、29d、28d、35d、33d、28d，月经平均周期在31.16±3.18d。在所有高峰值出现后7d（7.14±3.18d）左右可以观察到雌性红猩猩的交配行为，见图1。

2.3 孕酮的测定

经测定，雌性红猩猩的孕酮变化区间在0.2027～34.7544g/g DW，见图2。通过与雌二醇对比，6 个性周期仅确定3 个孕酮高峰，未捕捉到其他高峰值（见图3），可能与监测样本并非每天采集有关。

图1 红猩猩雌二醇（E2）变化趋势图

图2 红猩猩孕酮（P4）变化趋势图

图3 红猩猩雌二醇（E2）和孕酮（P4）变化趋势对比图

3 讨论

本研究采用了非损伤(noninvasive)采样方法，在雌性红猩猩不受人为干扰的情况下取其粪样来测定动物的激素水平，从而避免了人为因素干扰对激素分泌与释放的影响，Wasser和Lasley等[1-2]指出这种方法在许多研究尤其是野生物种的生理生态研究中有很大的应用潜力。这种采样方法克服了机械保定或化学麻醉对动物正常生理活动的影响，操作简单，对动物不易造成应激，也方便了其对野外种群的研究。近年来，在野生动物生殖生理研究中，关于这种非伤害法的检测报道也越来越多，如王英树等[3]研究了笼养丹顶鹤繁殖行为和粪样中性激素水平变化的关系；李淑玲等[4]对雄马鹿繁殖行为发生的频次与睾酮水平变化的关系进行了研究，均采用这种方法。

性腺激素在不同种动物体中的排泄途径有很大的差异，有研究表明，在正常情况下，粪便、尿液中性腺激素浓度与血液中性腺激素浓度呈正相关，但是性腺激素在血液、尿液和粪便中出现分泌高峰的时间是不一致的，相比较而言，粪便和尿液中的性腺激素分泌高峰迟于血液中的分泌高峰，而粪便中性腺激素代谢的时间很长，且时间不固定，这可能是由胆汁经过小肠到达直肠需要时间而引起的，在后肠发酵动物（猪、马、大象、犀牛、灵长类动物）中需24～48h[5-6]。本研究数据可以用于判定该雌性红猩猩的月经周期、是否妊娠和是否有黄体综合征，但要确定排卵期应采用尿液、血液和唾液中的激素水平数据来作为指标。

通过对该雌性红猩猩的粪便历时216d的检测，发现6个性周期，雌二醇变化区间在0.00134～0.71679g/g DW，其高峰值出现后7d（7.14±3.18d）左右可以观察到交配行为。根据雌二醇变化趋势，推算该雌性红猩猩的月经平均周期在31.16±3.18d。交配行为是繁殖的重要前提，也是性周期是否稳定的评判标准之一。结合饲养员对该雌性红猩猩的行为观察，在雌二醇高峰值出现后7d（7.14±3.18d）左右可以观察到该红猩猩有交配行为，这提示该雌性红猩猩的性周期较为稳定。孕酮变化区间在0.2027～34.7544g/g DW，峰值变化不明显，可能与监测样本采集有关。该雌性红猩猩在饲养过程中交配行为良好，却没有按照预期怀孕，本研究的数据证明该圈养雌性红猩猩的性周期雌二醇和孕酮激素水平正常，变化规律，但该雌性红猩猩一直以来没有怀孕的原因还有待进一步研究。本研究对红猩猩进行粪便的性激素检测，这种无创的检测方法可为该圈养雌性红猩猩日后的妊娠判定提供依据。