胆红素二甲酯与铜离子配合物的激发态光谱特性研究

闫姝君，刘阳依，和晓晓，郑 名，曹潇丹，徐建华，陈缙泉

华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室，上海 200062

引 言

金属离子会对BR/BRE的荧光特性产生影响，不同于Zn2+的荧光增强作用，Cu2+对BRE有明显的荧光猝灭。研究表明，高胆红素血症和胆结石等疾病与BR和Cu2+有关[3-5]，研究胆红素及其类似物与Cu2+的相互作用对这些疾病的防治有重要意义。线性四吡咯分子为适应与中心离子的配合，一般从原来的链式结构转变成类似卟啉的环状结构，一个Cu2+与一个BR/BRE分子的四个中心吡咯氮配位，形成金属中心的方形平面结构(图1)。BRE本身荧光量子产率较低，原因是吡咯环的振动使大部分激发态分子以无辐射方式弛豫回基态[6]。BRE与Cu2+配位后可能发生能级耦合产生新的非辐射退激发通路导致荧光减弱，但是有关Cu2+对BRE荧光的猝灭机制，还需进一步的研究。

图1 BR，BRE及其与Cu2+配合物的分子结构示意图Fig.1 Schematic structures of BR，BRE and Cu2+ complex

激发态分子的退激发过程一般发生在超快时间尺度内，传统稳态光谱技术无法观测。本文采用可见和近红外波段飞秒瞬态吸收光谱技术研究了BRE与Cu2+配合物的激发态光谱特性，不仅对其可见光波段的光谱进行了分析，还结合红外区域的光谱发现了Cu2+对BRE的荧光猝灭机制，首次提出并证实了荧光猝灭的原因是配体到金属的电荷转移(ligand-to-metal charge transfer,LMCT)。与BRE本身相比，这个电荷转移态为BRE-Cu2+配合物增加了一条非辐射退激发通路，使其荧光量子产率减小为BRE的～5%。通过拟合配合物激发态光谱的动力学曲线得到两个寿命，分别为11 ps和186 ps。其中11 ps为LMCT态的建立过程，186 ps为分子由此中间态弛豫回基态的时间。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

BRE，百灵威科技有限公司；无水醋酸铜，99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMSO，光谱级，>99.9%，上海麦克林生化科技有限公司；荧光素，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

紫外-可见分光光度计(TU1901,Beijing Purkinje General Instrument Co.Ltd)用于测紫外可见吸收光谱，可探测波长范围为190～900 nm，波长准确度为±0.3 nm。稳态荧光发射光谱数据的采集使用的是Horiba公司生产的FluoroMax-4型荧光光谱仪，由于不同的波长下光源的功率和探测器的探测效率都有所不同，所以我们选用S1c/R1c信号作为样品的荧光发射光谱。飞秒瞬态吸收系统的激光器是Coherent公司生产的Astrella，输出波长为800 nm，重复频率1 kHz，单脉冲能量>7 mJ，脉冲宽度100 fs；OPA是Coherent公司生产的OperA Solo，可产生240～2 600 nm内任意波长的光作为激发样品的泵浦光；光谱仪是Ultrafast System公司生产的Helios-EOS fire，由激光器产生的800 nm光束经过延迟线后打在氟化钙/蓝宝石晶体上，产生用于检测的白光脉冲，延迟线可达到的最长时间窗口为8 ns。

1.2 方法

胆红素是难溶于水的脂溶性物质，常用溶剂有二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)；由于羧基的存在，BR也可溶解于碱性溶液中[7]。BRE比BR有更强的亲脂性，考虑到金属离子可能与碱性物质发生反应，一般选用DMSO作为溶剂。配制BRE，BRE-Cu2+溶液(其中BRE和Cu2+的浓度比为1∶4，过量的Cu2+是为了使BRE与Cu2+充分结合)，溶剂为DMSO。用于测紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的BRE溶液浓度为10 μmol·L-1，BRE-Cu2+溶液中BRE浓度固定为10 μmol·L-1，改变Cu2+的浓度配制不同配比的BRE-Cu2+溶液，Cu2+浓度分别为10，40，100，200和400 μmol·L-1；用于测瞬态吸收光谱的BRE溶液浓度为50 μmol·L-1，BRE-Cu2+溶液中BRE和Cu2+浓度分别为50 μmol·L-1和200 μmol·L-1，配好的样品注意避光保存。

紫外-可见分光光度计测量光谱范围设置为300～900 nm，避免短波长的光损坏样品；稳态荧光光谱的激发波长430 nm，狭缝宽度为3/3 mm；飞秒瞬态吸收光谱系统中选择波长450 nm的脉冲作泵浦光，功率约为0.15 mW，探测光波长范围有340～740和750～850 nm两个波段，测量的时间窗口为500 ps(BRE)和3 ns(BRE-Cu2+)。

2 结果与讨论

BRE和Cu2+混合后，生成了稳定的配合物，如图2为BRE和不同浓度配比的BRE-Cu2+在DMSO中的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。BRE与Cu2+浓度比为1∶1时光谱发生明显改变，1∶4时已充分结合完全。BRE吸收峰和发射峰分别位于453和525 nm左右，可以看出，与Cu2+配位后，吸收峰蓝移约23 nm，且在815 nm附近出现了一个新的吸收带。从稳态荧光光谱可以看出，BRE-Cu2+的荧光发生了明显猝灭。我们以荧光素作为标准物，用相对法测定了BRE和BRE-Cu2+在DMSO中的荧光量子产率，发现BRE与Cu2+配合之后荧光量子产率降低为原来的5%。

为了探究Cu2+使BRE荧光猝灭的机理，我们用飞秒分辨的激光泵浦-探测技术对BRE-Cu2+进行分析。BRE和BRE-Cu2+配合物的瞬态吸收光谱如图3所示。BRE在380～490 nm范围内显现出明显的基态漂白(ground state bleaching,GSB)[8]信号。对于峰值位于350 nm附近和490～740 nm的宽谱正信号，是分子被泵浦到激发态后的激发态吸收(excited state absorption,ESA)。对于350和510 nm附近的ESA信号来说，在光谱的初期(仪器响应函数IRF≈120 fs)就达到信号的最大值，这说明二者均是BRE分子在接受光激发后所达到的初始激发态。而对于在550～650 nm左右、0～5 ps内逐渐上升的ESA信号，我们认为这是BRE分子退激发过程中经历的中间态，可能是因为BRE分子的扭转形成的。

图2 BRE(浓度为10 μmol·L-1)与BRE-Cu2+配合物(BRE浓度为10 μmol·L-1；Cu2+浓度分别为10，40，100，200，400 μmol·L-1)的紫外可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)Fig.2 UV-Vis absorption (a) and fluorescence emission spectra (b) of BRE (concentration:10 μmol·L-1) and BRE-Cu2+ complex (concentration of BRE:10 μmol·L-1;concentration of Cu2+:10,40,100,200,400 μmol·L-1)

表1 BRE与BRE-Cu2+的吸收、发射峰和荧光量子产率Table 1 Absorption，emission peak wavelength and fluorescence quantum yield of BRE and BRE-Cu2+ complex

当BRE分子与Cu2+形成配合物后，其瞬态吸收光谱信号发生明显变化。峰值为430 nm左右的负信号是典型的GSB信号，与紫外可见吸收光谱的吸收峰波长一致。峰值在480 nm附近且随时间推移逐渐蓝移(在200 ps时，峰值处波长约为475 nm)的是ESA信号，伴随着短寿命的激发态弛豫过程。从整体上看，500～600 nm之间BRE-Cu2+比BRE少了一个ESA峰。选取515和550 nm处的动力学曲线进行对比，如图4(a)，可以看出，BRE在515和550 nm附近有明显的中间态建立过程，而且两处上升沿趋势不同。而BRE-Cu2+则是直接到达激发态。光物理过程的明显区别说明BRE与Cu2+配位之后发生了能级耦合，我们猜想BRE的荧光猝灭可能是由于配体到金属的电荷转移(ligand-to-metal charge transfer,LMCT)导致辐射跃迁速率变低。

图3 BRE和BRE-Cu2+的瞬态吸收光谱Fig.3 Transient absorption spectra of BRE and BRE-Cu2+ complex

图4 BRE和BRE-Cu2+在515和550 nm处的动力学曲线Fig.4 Kinetics of BRE and BRE-Cu2+ complex at 515 nm,550 nm

为了验证上述理论，我们探测了红外区域的瞬态吸收光谱，如图5所示。由图2的紫外可见吸收光谱知BRE-Cu2+在815 nm附近产生了新的吸收带，而图5显示样品在805～840 nm处有正的ESA信号，而不是负的GSB信号，信号强度在十几皮秒时达到了最大，然后随时间减弱，说明此处的能态是样品分子被激发后的一定时间内生成的LMCT态，而不是分子本身的初始激发态。我们对数据进行全局拟合，得到两个寿命11和186 ps，如图6为839 nm处的动力学曲线，可以看出，这个中间态有一个建立的过程，因此我们认为11 ps的寿命就是LMCT态，即被激发的分子存在一个11 ps的配体到金属的电荷转移过程，然后以186 ps弛豫回基态。因此，Cu2+与BRE的配位导致BRE荧光猝灭的原因是发生了配体到金属的电荷转移，增加了一个激发态的非辐射弛豫通路，从而减小了辐射跃迁速率。此外，铜离子对胆红素、胆绿素等线性四吡咯分子的荧光也有猝灭作用，我们可以推测在这些结构类似的分子中，也存在吡咯环到铜离子，即配体到金属的电荷转移，这个激发态的电荷转移过程使配体分子发生荧光猝灭。

图5 BRE-Cu2+的红外区域的瞬态吸收光谱Fig.5 Transient absorption spectra of BRE-Cu2+ complex in infrared region

图6 BRE-Cu2+在839 nm处的动力学曲线Fig.6 Kinetic of BRE-Cu2+ complex at 839 nm

3 结 论

以胆红素二甲酯与铜离子的配合物为研究对象，用紫外可见分光光度法、稳态荧光发射光谱和飞秒瞬态吸收光谱等技术对其进行了分析。Cu2+对BRE有明显的荧光猝灭作用，使BRE-Cu2+的荧光量子产率降低为BRE的5%。配合物分子在吸收光子到达激发态后会伴随着振动弛豫、内转换、系间窜越、荧光发射以及电荷转移、质子转移等过程，它们通常发生在超快时间尺度内。瞬态吸收光谱技术是研究在液相中分子超快动力学的一种理想方法。BRE和BRE-Cu2+的瞬态吸收光谱表明，BRE与Cu2+发生了能级耦合，激发态的BRE-Cu2+出现了与BRE不同的光物理过程，荧光猝灭可能是由于配体到金属的电荷转移。然后我们在红外探测的瞬态吸收光谱中看到了LMCT态的信号，这个中间态有11 ps的建立过程，然后激发态分子以186 ps弛豫回基态。