SORL1、EPHA1基因多态性与新疆维吾尔族及汉族Alzheimer’s病的相关性研究

2020-06-13 06:14:48王晓蓓再图那木麦麦提明马衣日木赛买提王倩哈斯也提依不来音白睿
临床神经病学杂志 2020年2期
关键词:维吾尔族汉族等位基因

王晓蓓,再图那木·麦麦提明,马衣日木·赛买提,王倩,哈斯也提·依不来音,白睿

Alzheimer’s病(AD)是一种最常见的神经退行性疾病[1],世界卫生组织2016年的痴呆报告指出全世界有4 750万人患有痴呆,全世界每年新增770万例新发患者[2]。AD占所有类型痴呆的50%~70%,发病的机制尚不明确,可能的发病机制有以下几种:自由基学说、淀粉样蛋白斑块假说,神经原纤维缠结,炎性机制等,发病危险因素包括:老龄、阳性家族史、携带载脂蛋白Eε4(Apo Eε4)等位基因。但上述都不能完全解释该病的全部病变,经过全基因组关联分析(GWAS)发现SORL1基因、EPHA1基因是种新发现的AD致病基因,不同人群、不同地区、各民族中致病情况不完全一致,国外对于SORL1基因在AD患者外周血中的表达及变异情况报道较多,但国内报道却较少,关于维吾尔族AD患者的的研究更少。虽然国外文献表示这些基因与AD发病的生物学机制相关,但仍需要在不同人群、不同地区、各民族中进行反复验证。基于此本课题拟通过PCR法对维吾尔族及汉族AD患者和相应健康人外周血SORL1基因、EPHA1基因DNA测序分析,探索SORL1基因、EPHA1基因与新疆维吾尔族及汉族AD患者间的相关性和民族之间的差异,为临床早期诊断AD提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 收集来自2016年8月至2018年6月在新疆医科大学第二附属医院临床脑科中心就诊的及乌鲁木齐周边地区医院就诊的符合精神疾病诊断与统计手册第四版诊断标准并在新疆地区居住时间超过10年的维吾尔族AD患者及汉族AD患者。排除标准:抑郁症引起的假性痴呆,其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所引起的痴呆,正处于心、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。收集AD患者131例,年龄均≥65岁,平均(74.40±7.92)岁,均为散发性,其中维吾尔族 AD 72例(男35例,女37例),汉族AD 59例(男26例,女33例)。同期选择与病例组年龄、性别、生活环境及方式、民族习俗相匹配的非AD患者或健康志愿者做对照组,共128例,平均(75.20±7.59)岁,其中维吾尔族63例(男28例,女35例),汉族65例(男25例,女40例)。病例组与对照组之间性别、年龄、族别差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 全部患者及健康对照组采集外周静脉血3 ml。

1.2.2 基因组DNA的提取 全血提取基因组DNA使用TIANamp Genomic DNA kit提取试剂盒(北京天根生物技术公司)。严格按照说明书操作。

1.2.3SORL1基因及EPHA1基因测定 PCR技术及DNA测序检测SORL1基因、EPHA1基因位点的多态性。研究中SNP基因座信息来自于公共数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)GeneBank数据库,查询SORL1基因及EPHA1基因标准序列。引物序列参数见表1。委托北京博淼生物科技有限公司通过连接酶检测-聚合酶链反应(LDR-PCR)方法对SORLl、EPHA1基因的7个候选多态位点进行分型。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0进行统计学分析,计量资料若符合正态分布用均数±标准差表示,两组比较采用t检验,数据若不符合正态分布则用中位数(四分位间距)表示,采用Mann-WhitneyU检验。基因型资料采用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律的吻合度检验,计数资料以例数和率(%)表示,组间比较采用χ2检验和(或)Fisher 精确概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。多位点关联分析,使用多重检验校正bonferroni校正,P<0.0167表示差异有统计学意义。

表1 SORL1及EPHA1基因PCR引物位点引物名称PCR引物序列rs117675572nd-PCRPACGTTGGATGCCATCTTTCTTGTTGCCTCC1st-PCRPACGTTGGATGATGATGTCTTAGGGCATCTCUEP_SEQcCGATGCTGGGCAGTArs15251192nd-PCRPACGTTGGATGATGCTCAGAGTTTAAGTGAC1st-PCRPACGTTGGATGTAGAGGACAGAACACAGGACUEP_SEQggtcTTCAAGATTGCTTGAGGAAGATrs102330302nd-PCRPACGTTGGATGTGAGTCCCATCTGATATTCC1st-PCRPACGTTGGATGATGGTGAGCTTTGTGAGTGGUEP_SEQcccgCTTTACCCTCACCTCAGGArs16991022nd-PCRPACGTTGGATGAGAAGTGCAATGGATTCCGC1st-PCRPACGTTGGATGATCAGAGCAATCACGCAGACUEP_SEQATTCCGCTGCCCAAArs10101592nd-PCRPACGTTGGATGACCTGCCGAGAACCAAGAAG1st-PCRPACGTTGGATGGAAAGAACAGGAAAGAGGTGUEP_SEQcctgTAGATGAACAGCTAGTCATGrs22826492nd-PCRPACGTTGGATGGGGAGAAGAAAGTTGTGTG1st-PCRPACGTTGGATGCCCTTTCAAATGACTTTCAGUEP_SEQgctcAACTACGTTTCTCCATTTTCCrs38249682nd-PCRPACGTTGGATGGTGACTTTGACCTGGATGAG1st-PCRPACGTTGGATGACAAAGATGGGACCTACCTGUEP_SEQCCAAAAAAATGCCCTCTGC 注:1st-PCRP,前引物;2nd-PCRP,后引物;UEP_SEQ,单碱基延伸反应引物

2 结 果

2.1SORL1基因及EPHA1基因多态性分析结果SORL1基因的rs1699102、rs1010159、rs2282649、rs3824968位点的基因型及EPHA1基因rs11767557、rs1525119、rs10233030位点基因型检测结果符合Hardy-Weinberg平衡定律,见表2。

表2 AD病例组与对照组基因多态性检测结果基因位点病例基因型等位基因HWE(P)rs1010159TTTCCCTC 病例组1302365421111490.6736 对照组128295643114142rs2282649CCCTTTCT 病例组1312867361231390.9420 对照组128315938121135rs3824968AAATTTAT 病例组1312664411161460.6135 对照组128305939119137rs1699102TTTCCCTC 病例组131114080622000.6479 对照组12812417565191rs11767557CCCTTTCT 病例组13033394392210.6002 对照组1272309534220rs1525119TTTAAAAT 病例组130155758871730.3081 对照组12814476775181rs10233030GGGCCCGC 病例组1312364441101520.6203 对照组128275942113143 注:HWE:Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验

2.2 病例组与对照组基因型及等位基因分布的比较见表3。SORL1基因rs1699102、rs1010159、rs2282649、rs3824968位点与EPHA1基因rs11767557、rs1525119、rs10233030位点分布在病例组和对照组之间的差异无统计学意义(均P>0.05)。SORL1基因的rs2282649位点的等位基因分布在维吾尔族AD患者与汉族AD患者间的比较,差异有统计学意义(P<0.0167)。SORL1基因的rs1699102位点的基因型及等位基因分布在维吾尔族AD患者与汉族AD患者间的比较,差异有统计学意义(均P<0.0167)。EPHA1基因的rs10233030位点的基因型及等位基因分布在维吾尔族AD患者与汉族AD患者间的比较,差异有统计学意义(均P<0.0167)。

2.3SORL1染色体上形成LD等位基因的比较 见图1、表4。SORL1基因上汉族AD患者与对照组比较中发现,rs1010159、rs2282649、rs3824968形成单体型,维吾尔族AD患者与对照组比较中发现,rs16991102、rs2282649、rs3824968形成单体型。维吾尔族AD患者与汉族AD患者比较中发现,rs1010159、rs2282649、rs3824968形成单体型,前二者等位基因频率的比较中差异无统计学意义(均P>0.05)。维吾尔族AD患者与汉族AD患者中LD单倍体中ATC∶TCC碱基序列差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 病例组与对照组基因型及等位基因分布的比较基因位点组别基因型χ2值P值等位基因χ2值P值rs1010159TTTCCCTC 汉族组病例组926240.620.7344740.650.42对照组1329235575 维吾尔族组病例组1439181.950.3867750.0030.95对照组1627205967 病例组维吾尔族组1439183.470.1867752.580.10汉族组926244474rs2282649CCCTTTCT 汉族组病例组927230.810.6745730.620.43对照组1428235674 维吾尔族组病例组1940131.550.4666780.180.67对照组1531176165 病例组维吾尔族组1940137.660.0278666.692<0.01汉族组927234573rs3824968TTATAATA 汉族组病例组242690.620.7374440.650.44对照组2329137555 维吾尔族组病例组1738170.370.8372720.020.90对照组1730166462 病例组维吾尔族组1738174.660.1072724.240.05汉族组242697444

续表基因位点组别基因型χ2值P值等位基因χ2值P值rs1699102TTTCCCTC 汉族组病例组012474.200.12121061.920.17对照组3154721109 维吾尔族组病例组1128330.080.9650940.0010.97对照组926284482 病例组维吾尔族组11283323.00<0.001509421.64<0.001汉族组0124712106rs11767557CCCTTTCT 汉族组病例组216401.090.5820961.090.30对照组1144916112 维吾尔族组病例组117540.070.97191250.070.80对照组1164618108 病例组维吾尔族组117540.950.62191250.080.36汉族组216402096rs1525119TTTAAATA 汉族组病例组726251.060.6040760.780.38对照组724343892 维吾尔族组病例组831330.660.7247970.340.56对照组723333789 病例组维吾尔族组831330.100.9547970.100.75汉族组726254076rs10233030GGGCCCGC 汉族组病例组624280.690.7036800.630.42对照组929274783 维吾尔族组病例组1739160.820.6671730.080.78对照组1530186066 病例组维吾尔族组17391610.410.00573719.960.002汉族组625283781 注:rs11767557汉族病例组及汉族对照组均有1例未检出,rs1525119汉族病例组有1例未检出,rs10233030汉族病例组有1例未检出

图1SORL1染色体上形成LD单倍体图

2.4EPHA1染色体上形成LD等位基因的比较 见图2、表5。EPHA1基因上汉族AD患者与对照组比较,维吾尔族AD患者与对照组比较,维吾尔族AD患者与汉族AD患者比较中均发现rs1525119、rs10233030形成单体型。前两者比较中,LD形成的等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05),维吾尔族AD患者与汉族AD患者中LD单倍体中AC碱基序列差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 SORL1染色体上形成LD等位基因的比较(例,%)LD单倍体等位基因型汉族组病例组对照组χ2值P值rs3824968-rs2282649-rs1010159ATC73(61.9)74(56.9)0.6230.43TCT44(37.3)55(42.3)0.650.42LD单倍体等位基因型病例组维吾尔族组汉族组χ2值P值rs3824968-rs2282649-rs1010159ATC66(45.8)73(61.9)6.700.01TCT66(45.8)44(37.3)1.930.16TCC6(4.2)0(0)5.050.02ACC4.8(3.3)1(0.8)1.860.17LD单倍体等位基因型维吾尔族组病例组对照组χ2值P值rs16991102-rs2282649-rs3824968CAT64.9(45.1)60.9(48.3)0.290.59TTC48.9(34)43.9(34.9)0.020.88CTC23.1(16)20.1(15.9)00.98CAC6(4.2)1(0.8)3.030.08

图2 EPHA1染色体上形成LD单倍体图

表5 EPHA1染色体上形成LD等位基因的比较(例,%)LD单倍体等位基因型汉族组病例组对照组χ2值P值rs1525119-rs10233030AC40(33.9)45(34.6)0.010.9095AG37(31.4)47(36.2)0.640.4253TC41(34.7)38(29.2)0.860.3546LD单倍体等位基因型病例组维吾尔族组汉族组χ2值P值rs1525119-rs10233030AG71.8(49.8)36.9(31.3)9.200.0024TC45.8(31.8)41.0(34.8)0.260.6075AC25.2(17.5)40.0(33.9)9.26<0.01LD单倍体等位基因型维吾尔族组病例组对照组χ2值P值rs1525119-rs10233030AC25(17.5)23(18.3)0.150.69AG72(49.9)66(52.3)0.200.65TC46(31.9)37(29.3)0.040.85

3 讨 论

SORL1基因位于11号染色体上(11q23.2-q24.2),是低密度脂蛋白家族成员,也是AD发生有关联的排名前10的基因。基因组学数据显示52个SORL1基因位点中,29个位点与AD患病密切相关,与加勒比海地区的西班牙人、非裔美国人和个别白种人的相关性可分别达到98%、90%、53%[3-4]。AD患者脑组织中SORL1表达水平的降低能增加Aβ的产生[4]。许多研究都将SORL1基因的常见和罕见变异与AD联系起来[5-9],不同的变异在不同的研究中是相关的,风险影响范围从小的修改影响到因果影响不等。然而本研究中SORL1基因rs16199102、rs1010159、rs2282649、rs3824968多态性位点未发现与AD有相关性。El-Bitar等[10]在沙特阿拉伯AD患者中研究发现SORL1在家族和散发的AD中均起到一定的作用。然而本研究中AD患者均为散发型,且4个位点未发现与散发型AD有关这与Campion等[11]报道相一致。在晚发型LOAD中一项研究发现三个基因变异rs2070045,rs2282649和rs3824968及其标记的基因变异导致中国北方人和欧洲人群的患AD风险增高,这三种基因变异具有显著的遗传效应,调节人脑组织中SORL1的表达[9]。Ning等[12]研究中发现rs2070045和rs2282649是风险等位基因,但rs3824968与AD发病无相关性。本研究与上述研究结论部分不一致,考虑在LOAD的发病率及基因频率具有种族差异性,不同的人群、不同地区,SORL1基因需要在其他人群中进行验证[13]。张玉洁等[14]首次分析新疆哈萨克族人群SORL1基因的rs2070045及rs3824968位点,并未发现之间有相关性。张玉洁等[14]的研究与本研究均发现rs3824968与新疆AD患者发病无明显相关性,但上述结论需增加样本量,再次在人群中反复验证使结论可信。

有几项GWAS及候选基因测序发现,除了SORL1基因外,还有10个与 AD相关的危险因素包括:ABCA7、BIN1、CD2AP、CD33, CLU、CR1、EPHA1、MS4A6A、MS4A6E、PICALM。但少有相关报道指出AD与相应的风险基因表达水平之间有显著关联[15-17]。EPHA1基因位于7号染色体上(7q34-q35),rs11767557变异位于EPHA1上游约3 kb处,可能会改变邻近基因表达,进而导致AD的发生。Liu等[17]研究中rs11767557变异具有明显的调节作用EPHA1基因在人全血中的表达,非决定性的证据。这些发现可能进一步提供重要的补充rs11767557变异在AD发病中的调控机制。许多研究强调了rs11767557变异在欧洲人口中与AD风险密切相关,但本研究未发现EPHA1基因的rs11767557、rs1525119、rs10233030与AD的发生相关,AD的发生可能还与组织、细胞、区域、疾病的特异性因素来影响基因的表达,需进一步扩大样本量,从而得到可信的结果。

在本研究中,汉族rs16991102、rs2282649、rs3824968形成单体型模块,维吾尔族rs1010159、rs2282649、rs3824968形成单体型,rs1525119、rs10233030形成单体型,这些形成的LD模块中,SORL1基因SNP位点rs3824968-rs2282649-rs1010159形成的LD模块发现维吾尔族AD患者与汉族AD患者比较差异有统计学意义。EPHA1基因中rs1525119-rs10233030形成的LD模块在维吾尔AD患者与汉族AD患者中比较差异有统计学意义。Chou等[18]研究发现,台湾汉族人SORL1 的SNPs形成两个LD区,LD模块1是rs2070045-rs1699102,另外SNPs rs3824968-rs3737529-rs2282649-rs1010159形成一个模块。我们可以发现在不同地区、不同人群中的SNP形成的LD单倍体是有差异。这些差异可能在AD致病机制中也发挥不同作用,在白人、加勒比裔西班牙人和以色列阿拉伯人,SNPs位于SORL1基因组的5′端(SNPs 8-10)与AD的相关性最强[19-21]。然而,SNPs靠近SORL1的3′区基因组(SNP19和SNPs 22-25)与中国、日本、非洲和美国人有更为显著的关系[17.20-21]。亚洲群体之间的发现SORL1的3′区在其中的致病作用,进一步解释为什么最重要的单核苷酸多态性在不同的地区存在差异。

SORL1基因不同SNP位点,基因型分为野生型和突变型。本研究发现rs2282649中,维吾尔患者携带C等位基因较汉族AD患者携带T等位基因更容易患AD, rs3824968中T等位基因易导致维吾尔族患AD,rs1699102中T等位基因较C等位基因更容易使维吾尔族患AD,rs10233030中维吾尔AD患者更易携带G等位基因。在台湾人群中rs1784933与AD/MCI易感性相关比较中发现等位基因G具有保护作用[18],且在台湾人群中未发现rs1699102、rs2282649不同的等位基因在AD患者中起致病或保护作用。但在另一学者研究中发现中国内地的汉人rs1784933中G等位基因具有保护作用[22],同时发现SORL1基因rs2070045位点的G等位基因是危险基因,并且该等位基因在女性人群也是危险等位基因[23]。SORL1基因及EPHA1基因区域的多个位点的SNP,在各研究中位点选择差异,各研究中研究样本的差异,可能是各研究结果不一致的原因[24]。

综上所述,在本研究的样本中未发现SORL1基因的4个位点,EPHA1基因的3个位点与AD有关,可能原因如下:第一,AD发生机制比较复杂,不能用单一因素解释新疆AD患者SORL1基因、EPHA1基因与疾病之间的相关性。第二,可能因为本实验的局限性。希望未来有大样本的不同人群研究AD遗传基因的差异。

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