妊娠失败牛外周血中干扰素刺激基因和细胞因子的表达分析

（武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430065）

在奶牛场的日常饲养管理工作中，繁殖是重点所在，提高繁殖率是提高产奶量和牧场经济效益的关键。奶牛受胎率低或屡配不孕一直是困扰养殖户的重要问题，而妊娠早期胚胎死亡是导致奶牛繁殖障碍的重要原因之一[1]。研究发现，虽然反刍动物的受精成功率可达90%～100%，但最终成功分娩的只有大约55%，有将近一半的胚胎在妊娠早期发生了胚胎死亡，其中有2/3发生在妊娠的围植入期，表明约有30%的胚胎在配种后约21d内死亡，特别是在配种后14～19d的母体妊娠识别期死亡[2,3]。导致奶牛妊娠早期胚胎死亡的原因有来源于母体的，也有来源于胚胎本身的，主要包括胚胎与子宫间的互作障碍、内分泌环境以及母体营养和疾病等多方面因素。妊娠早期胚胎死亡会导致奶牛屡配不孕和发情延迟，从而延长产犊间隔，降低奶牛繁殖效率，增加饲养成本，最终造成奶牛场的经济损失。

反刍动物妊娠识别信号IFNT可引起母体外周血中干扰素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）和免疫反应相关细胞因子的表达变化，从而影响妊娠的建立和维持。ISGs在外周血中的表达模式可反映胚胎的发育状态，不仅可用于妊娠诊断，也可用于胚胎死亡的早期监测[4～8]。因此，为了探究奶牛妊娠早期胚胎死亡的原因和分子机理，本研究通过采集奶牛人工授精后0d、18d和28d的外周血液样本，检测ISGs和免疫相关细胞因子等的表达规律，并深入分析导致妊娠失败的原因，为奶牛配种后胚胎死亡高峰期保胎措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂与仪器

RNAprep Pure血液样品总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒RevertAid First-Strand cDNA Synthesis kit，为Thermo Scientific公司产品；普通PCR扩增预混液和荧光定量PCR扩增预混液(SYBR Green Master Mix），为南京诺唯赞生物科技有限公司产品；琼脂糖，购自Sigma公司；牛快速可视孕检试剂盒，购自美国IDEXX公司；QPCR引物，于北京擎科新业生物技术有限公司合成；Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪和尤尼柯紫外分光光度计，购自尤尼柯（上海）仪器公司。

1.1.2 样本采集

试验动物来自湖北省黄冈市某奶牛养殖场，选取健康状况良好、体况相近的未孕奶牛11头，经同期发情后进行人工授精。在配种后0d、18d和28d，通过尾静脉采集试验牛的血液样本，放入冰盒并迅速送至实验室提取总RNA或分离血清。经人工授精后28d血清PAG ELISA检测和42d直肠触诊确定妊娠失败牛9头，该9头牛的血液样本用于ISGs的分析。

1.2 试验方法

1.2.1 血液总RNA的提取及反转录

利用RNAprep Pure血液总RNA提取试剂盒提取血液样本中总RNA，具体步骤按试剂盒说明书进行，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，制备好的RNA样本保存于-80℃冰箱。RNA样本的反转录采用Thermo Scientific公司的RevertAidTM 第一链cDNA合成试剂盒进行，具体步骤参见说明书。

1.2.2 Real-time qPCR检测相关基因mRNA的表达变化

采用诺唯赞的SYBR Green Master Mix进行荧光定量PCR检测，反应体系为20μL：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA模板0.6μL，ddH2O补至20μL。每个样本重复3次。定量PCR在Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min，95℃10s，60℃ 30s，共40个循环，融解曲线采集程序为65～95℃，0.5℃/s，共10s。荧光定量PCR引物信息见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列信息

1.3 数据统计与处理

荧光定量PCR试验样品目的基因mRNA的相对表达量用2-△△Ct法进行计算，0d时各目的基因的相对表达量较正为1，其余各组的表达量均为0d的倍数。采用GraphPad Prism5软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准误”表示，采用t检验对试验结果进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 干扰素刺激基因在妊娠失败牛外周血液中的表达

ISGs在妊娠失败奶牛外周血液中的表达结果如图1所示，与人工授精后0d相比，试验牛配种后18d外周血中ISG15、RSAD2、MX1和RTP4 mRNA的表达量均无显著变化，其中RSAD2、MX1和RTP4 mRNA水平有上调的趋势，与0d时相比其平均上调倍数分别为2.01、1.66和3.49（P＞0.05）。

图1 妊娠失败牛外周血中ISGs mRNA的表达

2.2 Th1和Th2细胞因子在妊娠失败牛外周血液中的表达

荧光定量PCR检测Th1和Th2细胞因子在妊娠失败牛外周血中的表达结果如图2所示。与人工授精后0d相比，试验牛配种后18d外周血中IL-2、IFNγ和IL-4 mRNA表达分别平均上调1.98倍（P＜0.05）、2.07倍（P＞0.05）和1.28倍（P＞0.05），IL-10 mRNA表达平均下调1.38倍（P＜0.05）。

图2 妊娠失败牛外周血中Th1、Th2细胞因子mRNA的表达

2.3 CCL8和CXCL10在妊娠失败牛外周血液中的表达

趋化因子CCL8和CXCL10在妊娠失败牛外周血中的表达结果如图3所示。与人工授精后0d相比，试验牛配种后18d外周血中CCL8 mRNA表达平均下调1.37倍（P＜0.05），CXCL10 mRNA表达平均上调2.90倍（P＞0.05）。

图3 妊娠失败牛外周血中CCL8和CXCL10 mRNA的表达

3 讨论

在过去数十年中，由于遗传选育和生产管理及营养水平的不断提高，奶牛的产奶量得到了显著提升，然而高产奶牛的繁育性能却表现出明显的下降，特别是早期胚胎死亡的高发生率，成为造成奶牛场经济损失的主要原因之一[12,13]。研究指出在妊娠早期IFNT不仅可引起子宫组织，也可引起黄体和外周血白细胞中如ISG15、MX1、RTP4等ISGs的表达上调，为反刍动物早期妊娠诊断方法的建立提供了分子基础[14,15]。然而，也有研究表明ISGs的高表达可能与牛配种后早期胚胎损失的发生密切相关[8,16]。基于此，本试验检测了妊娠失败牛人工授精后0d和18d外周血中经典ISGs的表达，结果显示与0d相比，18d时血液中ISG15 mRNA的表达有轻微下降趋势，而RSAD2、MX1和RTP4的表达有上调的趋势，但统计分析无显著差异。程蕾等研究结果指出，与0d时相比，空怀牛18d时外周血中ISG15基因呈下调表达，RSAD2的表达无显著变化[17,18]。Shirasuna等[19]学者也有类似的发现，在空怀牛或早期胚胎死亡牛外周血单核细胞中ISG15的表达量无显著变化，本试验结果与前人研究结果基本一致。此外，在本试验结果中分析发现，妊娠失败牛配种后18d血液中RSAD2基因表达相比0d时平均上调2.01倍，MX1基因平均上调1.66倍，RTP4基因平均上调3.49倍，虽然平均上调倍数较大，但统计分析显示仍不具备显著性差异。本试验结果与Kose等[8]的研究报道具有一定的相似之处，该研究小组发现在发生胚胎死亡的绵羊外周血白细胞中RTP4和MX1 mRNA的表达量在18d时呈极显著上调，而本试验结果显示MX1和RTP4虽也呈上调表达，但无显著差异，这可能与本研究中实验牛头数相对较少且由于遗传或营养等因素引起的个体间差异较大有关。

在反刍动物早期妊娠期间，Th细胞及其细胞因子的动态平衡在避免胚胎遭受母体的免疫排斥，保证胎儿的正常发育中发挥重要作用。Th1细胞因子包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，在妊娠过程中可增强机体的免疫反应，是促炎性细胞因子；Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，可发挥抗炎作用抑制机体的免疫反应[20]。在正常的妊娠情况下，母体Th1细胞因子受到抑制，而Th2细胞因子分泌增加[21]。本研究检测了妊娠失败牛血液中Th1和Th2细胞因子的表达，结果显示妊娠失败牛配种18d时血液中IL-2的表达量显著高于0d（P＜0.05），IFN-γ 的表达相比0d也平均上调2.07倍（P＞0.05），且18d时IL-10的表达量呈显著下调（P＜0.05），这与前人的研究结果基本一致[10]，表明Th1与Th2细胞因子表达水平的失衡可能是导致本研究中实验牛妊娠失败的原因之一。但在本研究结果中也发现配种18d时IL4的表达相比0d上调1.28倍（P＞0.05），这可能与实验牛头数及个体间差异较大有关。

CCL8是趋化因子CC家族中的一员，由单核细胞和巨噬细胞分泌产生，CXCL10属于CXC家族，由中性粒细胞、单核细胞和NK细胞等多种免疫细胞在受IFN-γ刺激后分泌产生，两者均在机体炎症反应和免疫调节中发挥重要作用[22]。有研究表明早期妊娠可引起牛子宫内膜CCL8和CXCL10的表达增加，且CCL8可下调牛子宫内膜COX-2和催产素受体的表达[23]，CXCL10在促进胚胎滋养层与子宫内膜的黏附中也发挥重要作用[24]。本试验检测了妊娠失败牛血液中CCL8和CXCL10的表达，结果显示妊娠失败牛配种18d时血液CCL8的表达量显著低于0d（P＜0.05），而CXCL10的表达相对0d平均上调2.90倍（P＞0.05）。Sakumoto等[11]学者研究发现，发生早期或晚期胚胎死亡牛配种18d时外周血白细胞中CCL8和CXCL10 mRNA的表达与14d相比均无显著差异，与本试验结果存在一定的不同之处，可能的原因是实验动物品种及样本比较分析的时间点不同。研究表明，CXCL10可由IFN-γ和IFNT刺激产生，与靶细胞上的受体结合后可通过一系列炎症反应信号通路介导Th1细胞因子产生，同时抑制Th2细胞因子[25]，因此，这可能与本试验结果中IL-2的显著上调表达，以及IL-10的显著下调表达相关。

4 结论

本研究通过对人工授精后妊娠失败牛外周血中ISGs和免疫反应相关的细胞因子的检测分析发现，配种18d时RSAD2、MX1和RTP4的表达虽无显著变化，但均呈上调趋势，提示ISGs的高表达可能对早期妊娠产生不利影响；此外，18d时IL-2的显著上调表达，以及IL-10和CCL8的显著下调表达可能是导致母体免疫失调，引发早期胚胎死亡的原因。本研究可为奶牛早期妊娠失败的原因提供基础参考，并为奶牛配种后胚胎死亡高峰期保胎措施的制定提供理论依据。