FZD3和Nrf2在牙源性角化囊肿组织中的表达及其意义

赵家欣 禹雯怡 邱建忠2 唐永平2 万梅2 杨芳 袁荣涛

(1 青岛大学口腔医学院，山东 青岛 266003； 2 青岛市市立医院口腔医学中心)

牙源性角化囊肿(OKC)是一种单囊或多囊的牙源性上皮囊肿，具有局部侵袭的特征,可引起颌骨骨质膨隆，易造成颌骨破坏和面部畸形，手术刮除后易复发，2017年世界卫生组织(WHO)将其由颌骨良性肿瘤重新划归于牙源性颌骨囊肿[1]。目前的研究表明，造成OKC病变增大、颌骨破坏的主要因素有衬里上皮过度增生、囊内压升高以及囊内前列腺素、胶原酶、白细胞介素-1、金属基质蛋白酶等因子导致周围骨质吸收[2]。OKC的具体发病机制尚不清楚，可能与Wnt信号通路的异常激活有关系，研究显示Wnt信号通路相关基因FZD3在OKC中高表达，应用Wnt信号通路阻断剂EGCG溶液开窗灌洗治疗OKC疗效显著，开窗灌洗治疗以后，FZD3基因的表达降低并接近于正常口腔黏膜，提示Wnt信号通路相关基因FZD3可能与OKC的发生发展有关[3-5]。另有研究表明，氧化应激可能参与OKC的发生和发展[6]。活性氧(ROS)介导的氧化应激反应在许多疾病发展过程中起重要作用，当机体暴露于活性氧刺激时，会产生一系列氧化应激反应，保护细胞免受损害[7-8]。Nrf2是氧化应激反应中的关键因子，对细胞内多种抗氧化基因的表达起调控作用，其活化是细胞主要的防御机制之一。Nrf2通过清除代谢毒物、致癌物等方式在肿瘤预防中发挥积极作用[9]。Nrf2在OKC中的表达及在OKC发生发展中发挥的作用还需要进一步的深入研究。本研究应用免疫组织化学方法检测FZD3和Nrf2蛋白在OKC囊壁上皮中的表达情况，探讨FZD3、Nrf2在OKC发生发展中可能发挥的作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2015年1月—2019年10月于青岛市市立医院口腔颌面外科行开窗减压术治疗的22例OKC患者手术中切取的囊壁组织(实验组)及其周围正常口腔黏膜组织(对照组)标本，均经病理学检查确诊。

1.2 主要仪器与试剂

FZD3兔抗人多克隆抗体(A10063)购买自武汉爱博泰克生物科技有限公司，Nrf2兔抗人多克隆抗体(E-AB-32280)购买自武汉伊莱瑞特生物公司；PV6000免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂购买自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1免疫组织化学方法检测组织中FZD3、Nrf2蛋白的表达 标本组织置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，5～8 μm厚切片。应用免疫组织化学方法检测两种组织中FZD3、Nrf2蛋白的表达情况，严格按照说明书要求的步骤进行操作。FZD3和Nrf2检测中均以人肺癌组织作为阳性对照。

1.3.2结果判定标准 FZD3表达评分标准在参照相关文献[10-11]基础上进行了改进，100倍镜下观察切片，200倍镜下计数阳性细胞，根据染色强度和阳性表达的细胞百分比综合评分，细胞浆中出现浅黄色或棕褐色颗粒为表达阳性。染色强度计分方式为：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；各切片随机选择5个高倍视野，各视野计数1 000个细胞，根据阳性细胞比例的平均值进行计分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。两种计分的乘积作为FZD3表达的判定标准：0～2分为阴性，3～5分为弱阳性，6～8分为中等阳性，9～12分为强阳性。Nrf2表达评分标准在参照相关文献[12]的基础上略加以改进，以细胞浆出现棕褐色颗粒为Nrf2表达阳性，并参照上述FZD3蛋白的判定标准，Nrf2表达的计分为：0～1分为阴性，2～4分为弱阳性，5～7分为中等阳性，8分以上为强阳性。免疫组织化学结果由两位经验丰富的病理医师双盲法独立评定，两位医师判定结果有分歧时请第三位医师重新进行评估，直至达成一致结果。

2 结 果

2.1 两种组织中FZD3蛋白表达情况比较

免疫组织化学染色结果显示，实验组FZD3蛋白中等阳性表达16例(图1A)，强阳性表达6例(图1B)；对照组FZD3蛋白弱阳性表达22例(图1C)。两组比较差异有显著性(Z=-6.255,P<0.01)。

2.2 两种组织中Nrf2蛋白表达情况比较

免疫组织化学染色结果显示，实验组Nrf2蛋白弱阳性表达3例(图2A)，中等阳性表达6例(图2B)，强阳性表达5例(图2C)，阴性表达8例(图2D)；对照组Nrf2蛋白阴性表达22例(图2E)。两组比较差异具有显著性(Z=-4.387,P<0.01)。

3 讨 论

Wnt信号通路有3条途径，包括依赖于β-catenin的经典的Wnt信号通路以及独立于β-catenin的非经典Wnt信号通路，后者有Wnt/JNK和Wnt/Ca2+的信号通路。Wnt/β-catenin信号通路是一条在进化过程中高度保守的通路，在胚胎发育中起重要的信号转导作用，参与调控细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等[13]。

大量研究发现Wnt信号通路在人类肿瘤性疾病中发挥一定的调控作用[14]。DUTRA等[15]学者通过免疫组织化学方法检测发现，成釉细胞瘤和牙源性钙化囊性瘤Wnt信号通路中的Wnt1、Wnt5a、β-catenin蛋白表达异常，表明Wnt信号通路可能与牙源性肿瘤或囊肿的发生有关。

FZD3是卷曲蛋白受体家族成员之一，属于跨膜蛋白，与Wnt配体结合可启动Wnt信号通路[16]。研究表明，FZD3在食管癌、胃癌、结直肠癌等多种消化道肿瘤中表达上调，提示FZD3可能与消化道肿瘤的发生发展有关[17-19]。通过下调FZD3，可抑制人类黑色素瘤的生长和转移[20]。另有研究表明，通过上调FZD3/5并激活Wnt信号通路，能减轻阿尔茨海默病(AD)模型小鼠神经元的氧化应激损伤，抑制细胞凋亡[21]。本课题组前期研究发现，非经典Wnt/FZD3/JNK3信号通路对颌骨OKC的转归起调控作用，OKC中FZD3 mRNA高表达[5]。体外培养OKC囊壁上皮细胞时，加入Wnt信号通路抑制剂EGCG以后，OKC囊壁上皮细胞增殖被抑制，Wnt信号通路相关蛋白FZD3表达下调[22]。这些研究从不同层面阐明Wnt信号通路相关蛋白FZD3在颌骨OKC的发生发展过程中可能起一定的调控作用。本研究结果显示，FZD3蛋白在颌骨OKC囊壁上皮组织中呈阳性表达，从组织学水平验证了Wnt通路相关蛋白FZD3在OKC囊壁组织中异常激活，提示其可能与OKC的发病有关。

A：实验组FZD3蛋白中等阳性表达；B：实验组FZD3蛋白强阳性表达；C：对照组FZD3蛋白弱阳性表达。PV6000法，200倍

图1 两组组织中FZD3蛋白表达情况比较

A：实验组Nrf2蛋白弱阳性表达；B：实验组Nrf2蛋白中等阳性表达；C：实验组Nrf2蛋白强阳性表达；D:实验组Nrf2蛋白阴性表达；E：对照组Nrf2蛋白阴性表达。PV6000法，200倍

图2 两种组织中Nrf2蛋白表达情况比较

Nrf2是Cap-n-collar(CNC)转录因子家族成员，是细胞对抗氧化应激反应的主要调节因子，被称为抗氧化反应的“总开关”。正常生理状态下，Nrf2定位于细胞质中，与Keap1结合，而Keap1能促进Nrf2的泛素化而被降解。当细胞受到ROS或亲电体刺激时，Nrf2与Keap1分离，免于泛素化降解。解离后的Nrf2进入细胞核中与ARE结合，促进靶基因的表达。Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞防御氧化应激损伤的最重要的机制之一[23]。在Nrf2-Keap1信号通路中，若肿瘤细胞中的Nrf2与Keap1的结合机制被破坏，则会被赋予高水平的耐药性以及ROS抗性，并引导癌细胞的代谢重编程[24]。如在乳腺癌细胞、肺腺癌细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞中均发现可通过Nrf2-Keap1通路调控肿瘤的缺氧保护作用[25-27]。

Nrf2介导了许多涉及氧化还原反应的基因表达，激活Nrf2在细胞水平能拮抗氧化应激，表现为抗氧化、抗凋亡作用[28]。激活的Nrf2可调控下游多种抗氧化因子如血红素氧合酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽氧化还原系统、过氧化氢酶等的表达，减少ROS的生成，改善细胞氧化损伤[29]。然而，值得注意的是，目前大量研究表明Nrf2在癌症发展中具有双重作用。一方面，Nrf2保护正常细胞免受氧化应激损伤，预防细胞癌变；另一方面，Nrf2在多种肿瘤细胞中呈高表达，过度激活的Nrf2可促进肿瘤发展和肿瘤细胞的生长转移[30-31]。

本研究结果显示，在OKC囊壁组织中，Nrf2蛋白的表达显著高于正常口腔黏膜组织，提示Nrf2可能参与OKC的氧化应激反应，在OKC的发生发展中发挥重要作用。但是Nrf2在OKC上皮细胞生长调控中的具体作用及其机制，以及Nrf2的过度激活与OKC发生发展的关系，仍有待于进一步研究和探讨。