药用植物三七和金银花多糖提取工艺优化与比较

魏晓梅，杨文敏，聂贤锋，吴丽芳

(曲靖师范学院生物资源与食品工程学院，云南高原生物资源保护与利用研究中心，云南 曲靖 655011)

金银花(LonicerajaponicaThunb.)属忍冬科，多年生半常绿缠绕及匍匐灌木，唇形花有淡香，初夏开花，开放前采收干燥，属国家名贵药材之一。我国金银花主要产于山东平邑、苍山、费县和河南新密、巩义、登封等地[1]。金银花多糖具有抗凝血[2]、免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒、抗辐射、降血压、降血糖、降血脂[5]等多种作用，是一类重要的生物活性物质[6]。刘蓓等发现金银花多糖浓度10～250 ug/ml时可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖[7]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. chen ex C. H.)属五加科多年生草本植物，根状茎呈圆柱形，块根及花都有很高的药用价值[8]，三七的研究重点主要在三七总皂苷领域[9]。此外，三七多糖也是三七中重要的活性成分[10]，在免疫调节上具有很大优势[11]，且具有较强的清理ABTS和DPPH自由基的能力，抗氧化活性较高[12]。因此，三七及金银花多糖因其药用价值被作为研究热点，如刘杰[13]对土三七的多糖提取方法及成分进行了详细探索。殷红梅等[14]对金银花多糖提取过程中脱蛋白的工艺进行了优化。赵鹏等[15]用响应面法优化多糖的修饰及加工，但未见三七及金银花的多糖对比研究。本研究采用正交试验分别研究金银花和三七块根中多糖的提取，探讨并对比其最佳提取工艺，进而比较两者粗多糖的含量差异，为其进一步开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三七采自云南省文山州丘北县二年三七，金银花采自河南省巩义市浮戏山山区。

1.2试剂和仪器设备

离心机(80-1)，数显鼓风干燥箱(G2X-9070 MBE)，电子天平(AL240-1C)、恒温光照培养箱(SPX-250B-G型)、754紫外分光光度计(上海菁华)，电热恒温水浴锅(DK-S26)等。

乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)，氯仿(天津化学试剂三厂)，丙酮(天津市化学试剂三厂)，正丁醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)等，以上皆为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

采用多因素多水平正交设计(表1、2)，选取云南文山的三七根与河南巩义的金银花为原材料，提取样品中多糖，探讨其多糖提取的最佳工艺，并对比两种样品中多糖含量的差异，为进一步开发利用提供理论支持。

表1 L934法提取金银花多糖试验设计

表2 L934提取三七多糖试验设计

1.3.2 试验方法

金银花与三七根分别洗净，粉碎，80℃烘干至恒重，按照试验设计进行高温浸提，然后过滤并保存浸提液，过滤后滤渣再次浸提，合并提取液3500 r/min离心15 min，上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/2，按照设计的醇沉浓度4℃低温醇沉24 h，3500 r/min离心15 min，Sevag法除去蛋白质，至多糖溶液在250～280 nm处无紫外吸收峰为止。氯仿抽提，80%乙醇醇沉，丙酮洗涤，60～70℃烘箱干燥4 h，恒重后称量所得多糖。记录并分析。

为研究浸提温度对金银花多糖提取的影响，本研究在其它条件相同的基础上设置了温度梯度40，50，60，70，80，90，100℃条件下探讨多糖提取的差异。金银花洗净烘干，粉碎，称取2 g加入20倍蒸馏水分别置于不同的温度条件下浸泡3 h，过滤并保存提取液。滤渣中加入20倍蒸馏水重复上述过程，共提取2次，合并提取液3500 r/min离心15 min，取上清液，氯仿萃取2次，70%乙醇醇沉。

根据此试验结果选择三个温度水平纳入正交试验的一个因素，另选择三个因素设计金银花多糖提取正交试验(见表1)。

三七根洗净，烘干，粉碎，分为9组每组称量2 g三七粉，无水乙醇浸泡除去色素，再次离心干燥，按照表2中的四因素三水平进行试验，90℃水浴浸提，离心取上清液，浓缩后分别加入相应体积乙醇进行醇沉，静置过夜，洗涤，离心弃上清，干燥后称重。

2 结果与分析

2.1 不同温度对金银花多糖提取的影响

在其它试验条件完全相同，但采用不同浸提温度提取金银花多糖试验中发现，温度不同金银花浸提液的色泽差别较大，浸提温度越高，浸提液颜色越深，说明金银花中含有一定的色素，这些色素会随着温度的升高越容易被提取出来。此外，在醇沉时，观察发现60℃醇沉时多糖质地均匀细腻，但得量较低，每克金银花提取多糖0.0245 g(见表3)，80℃条件下多糖得量有所提高，100℃时多糖得量最大，每克金银花提取多糖0.0391 g，但多糖质地较粗糙。但总体呈现浸提温度越高，多糖提取量越大的趋势。据此，在金银花多糖提取的正交试验中，浸提温度分别选择三个有代表性的60℃，80℃，100℃。

表3 不同温度条件下金银花多糖提取率

2.2 正交试验提取金银花多糖结果分析

试验9(A3B3C2D1)提取得到金银花粗多糖量较多(见表4)，每克金银花可提取粗多糖0.0305 g，试验4(A2B1C2D3)提取得到金银花粗多糖量最少，每克金银花提取粗多糖量仅0.0180 g，且不同的试验组合多糖提取量有较大的差异。

表4 L9(34)法正交试验提取金银花多糖的结果

计算相应的K值并对比发现， 与KA2和KA3相比，KA1最大，说明浸提时间3 h为最佳方案，浸提时间延长反而多糖提取质量降低；KB3则明显高于KB1和KB2，表明温度越高(100℃)提取效果越好；KC2高于KC1和KC3，但三者差距最小，故氯仿浸提次数对多糖提取影响程度相对于其它因素来说最小，浸提两次最佳；KD2高于KD1和KD3，说明醇沉浓度70%最佳。

计算R值并对比发现，选择的4个因素对金银花多糖提取的影响力为B > D > A > C，即浸提温度对金银花多糖提取量影响最大，此结果与表2显示的结果一致，随着温度上升，多糖得量也逐渐上升；其次是醇沉时乙醇浓度，乙醇浓度为70%时，金银花多糖提取量最多；然后是浸提时间，浸提3 h时有较好的提取效果；氯仿萃取次数影响最小，次数增加对多糖提取量影响不大。因此，为缩短提取时间可选择较低的萃取次数。

由试验结果可得最佳金银花多糖提取试验组合为A1B3C2D2，即100℃热水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉浓度70%。

2.3 正交试验提取三七多糖结果分析

由三七多糖提取结果分析可知，试验组合3(A1B3C3D3)提取得到的三七粉粗多糖量较多(见表5)，每克三七粉提取粗多糖0.1596 g，试验组合5和组合8分别为0.0224 g/g和0.0220 g/g；试验组合4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量仅为0.0498 g，且不同的试验组合粗多糖提取量差异较大。

表5 L9(34)法正交试验提取三七多糖的结果

计算相应的K值并对比发现，KA1> KA3> KA2，KA1最大，说明最佳料液比是1:20；KB3> KB2> KB1，表明浸提次数的增加能显著增加三七粗多糖提取量；KC3> KC1> KC2，说明浸提时间3h有较好的提取效果；KD3> KD1> KD2，说明醇沉浓度80%最佳。

计算R值并对比发现，选择的4个因素对三七多糖提取的影响力为D > C > B > A，即醇沉浓度对三七多糖提取量影响最大；其次是浸提时间及浸提次数；最后是料液比。

因此，三七多糖最佳提取试验组合为A1B3C3D3，即料液比1:20条件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉浓度80%可得到最多的多糖提取量。

2.4 三七与金银花多糖提取量比较

分析金银花与三七正交试验的9个试验组合，我们发现金银花多糖提取的试验组合9(A3B3C2D1)中每克金银花可提取粗多糖0.0305 g，三七多糖提取试验4(A2B1C2D3)中每克三七提取粗多糖0.1596 g，表明云南文山三七粗多糖的提取量明显高于河南巩义的金银花多糖提取量；金银花提取试验4(A2B1C2D3)提取得到的金银花粗多糖量最少，每克金银花提取到粗多糖量仅为0.0180 g，而三七多糖提取试验4(A2B1C2D3)提取得到的三七粉粗多糖量最少，每克三七粉提取到粗多糖量为0.0498 g，即云南文山的三七粗多糖的提取量依旧明显高于河南巩义的金银花多糖提取量。因此，云南文山的三七粗多糖含量应高于河南巩义的金银花粗多糖含量。

3 结论

对于植物多糖的研究，国内外对三七多糖的研究相比较其它药用植物来说相对较少[11]，更鲜少研究不同药用植物之间多糖提取及其对比分析。药用植物多糖的研究必将进一步指导多糖在临床方面的应用，为人类造福。金银花多糖提取试验中影响因素较大的是浸提温度，其次是醇沉时乙醇的浓度，然后是浸提时间，氯仿萃取次数影响最小。金银花多糖提取的最佳试验方案为A1B3C2D2，即100℃热水浸提3 h，氯仿萃取2次，醇沉浓度70%，可得到较多的粗多糖提取量。提取三七多糖时影响较大的因素是醇沉浓度，其次是浸提时间及浸提次数，最后是料液比。三七多糖提取的最佳方案为A1B3C3D3，即料液比1∶20条件下90℃浸提3次，每次浸提3 h，醇沉浓度80%可得到最多的多糖提取量。云南文山三七根中多糖含量高于河南巩义金银花中多糖含量。