TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在非小细胞肺癌中的表达及意义

张久荣， 林勇， 徐春华， 胡慧娣， 吕亚军

(1. 南京市胸科医院呼吸内科， 江苏 南京210029； 2. 南京市胸科医院病理科， 江苏 南京210029； 3. 常州市武进人民医院胸心外科， 江苏 常州 213017)

每年约有160万人死于肺癌[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是最常见的亚型，占80%～85%。超过一半的NSCLC患者在确诊时已是Ⅳ期，无法行手术治疗，导致患者预后差[2]。目前NSCLC患者的5年生存率不足15%，且复发率较高[3]。Twist蛋白由TWIST家族bHLH转录因子1(TWIST family bHLH transcription factor 1，TWIST1)编码，是一种含有螺旋-环-螺旋结构域的转录因子，在胚胎发育及肿瘤侵袭转移中发挥重要作用[4]。，而Fascin蛋白由束蛋白结合蛋白1(Fascin actin-bundling protein 1，FSCN1)编码，其在多种肿瘤中呈高表达，广泛参与癌细胞增殖、侵袭和迁移等，且是霍奇金淋巴瘤及EB病毒相关淋巴瘤的肿瘤标志物[5]。目前，关于TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在肺癌发生发展中的作用尚不清楚，本研究拟应用生物信息学及临床标本分析TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 生物信息学分析

TCGA可视化网站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)包含多种肿瘤的表达谱数据，在该网站首页分别输入“TWIST1”及“FSCN1”，点击“GoPIA”之后网站会自动弹出mRNA相关信息以及在不同肿瘤中的表达情况。进一步在该网站“Expression DIY”及“Survival Analysis”模块下分析TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC两种主要病理类型(肺腺癌和肺鳞癌)中的表达及临床意义。此外，在“Correlation”模块下分析TWIST1 mRNA与FSCN1 mRNA在肺腺癌及肺鳞癌中表达的相关性。

1.2 病例

本研究所有临床标本均从南京市胸科医院胸外科获取，从2015年1月至12月共搜集到69对NSCLC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm以上)，所有患者均接受根治性切除手术并且术前未进行放疗、化疗。患者临床资料(病理类型、性别、年龄、吸烟史、TNM分期等)从病历记录中获取，病理类型由两名经验丰富的病理医师确定。69例肿瘤标本中，肺腺癌39例，肺鳞癌30例；男36例，女33例；年龄38～78岁，中位年龄60岁，其中32例<60岁，37例≥60岁；吸烟者35例，非吸烟者34例；Ⅰ期24例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例；有淋巴结转移38例，无淋巴结转移31例。组织标本浸泡在RNA保护液中，于-80 ℃保存。该研究经南京市胸科医院医学伦理委员会批准并且获得患者知情同意。

此外，对69例NSCLC中TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表达进行排序，将前35例定义为高表达组，将后34例定义为低表达组，分析TWIST1及FSNC1与患者临床病理特征的相关性。

1.3 组织RNA提取

切取组织，磨成碎片，加入Trizol 试剂(美国Thermo公司)裂解组织，并于4 ℃行12 000×g离心15 min；取上清液加入氯仿，室温静置5 min，并如上述操作离心；吸取上层水相至新EP管，加入异丙醇，于4 ℃行12 000×g离心10 min；取沉淀加入75%乙醇，于4 ℃行7 500×g离心5 min，获得RNA沉淀。根据沉淀的量，加入适当体积的无RNA酶水溶解RNA产物，并利用分光光度计(北京普析公司)检测其浓度。

1.4 RNA反转录

使用反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)进行反转录反应。在EP管中加入4 μL 5×反转录试剂混合液，1 μg RNA(根据浓度加入适当体积)，并用无酶水定容至20 μL。混匀反应体系后，PCR仪(美国Stratagene公司)中设置反应体系：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保持。获取目标cDNA后进行实时定量PCR检测。

1.5 实时定量PCR检测TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表达

引物由南京金斯瑞生物工程公司合成。TWIST1上游引物为5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，下游引物为5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′，扩增长度156 bp；FSCN1上游引物为5′-CCAGGGTATGGACCTGTCTG-3′，下游引物为5′-GTGTGGGTACGGAAG GCAC-3′，扩增长度105 bp；GAPDH上游引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，扩增长度197 bp。在96孔板中，每个反应中加入10 μL 发光反应液，0.4 μL正向引物，0.4 μL反向引物，0.4 μL 荧光标准液，5 μL cDNA模板以及3.8 μL蒸馏水，共20 μL体系。行PCR扩增：95 ℃预变性 30 s；5 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。使用管家GAPDH mRNA作为内参，以癌旁组织为对照组，使用2-ΔΔCT方法分别计算TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在NSCLC中的表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 GEPIA生物信息学分析结果

2.1.1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA在NSCLC中表达及临床相关性 GEPIA网站分析显示，与癌旁组织相比，TWSIT1 mRNA和FSCN1 mRNA在肺腺癌和肺鳞癌组织中表达明显升高(P均<0.05)，其中肺鳞癌更明显。生存分析显示，TWIST1 mRNA 与患者的总体生存期无明显相关(P=0.160)；而FSCN1 mRNA与患者预后相关，FSCN1 mRNA低表达者总体生存期较高表达者更长(P=0.007)。见图1。

图1 GEPIA网站中TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 在NSCLC中的表达及与总体生存期的关系

2.1.2 TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的表达在肺腺癌和肺鳞癌中的相关性 进一步分析GEPIA发现，在肺腺癌中TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表达呈中等程度正相关(r=0.41，P<0.01)，在肺鳞癌中两者表达呈弱相关(r=0.17，P<0.01)。见图2。

2.2 临床标本验证结果

2.2.1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 在NSCLC中表达及相关性 结果表明，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在69对NSCLC组织中表达明显高于对应的癌旁组织(t=7.452，15.12，P<0.01)。

相关性分析结果显示，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表达呈正相关(r=0.630，P<0.01)。见图3。

图2 NSCLC中TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA表达相关性

图3 TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在NSCLC中表达及相关性

2.2.2 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA 表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 分析结果表明，TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表达与患者TNM分期以及有无淋巴结转移相关(P<0.05)，但与患者的性别、年龄、吸烟史以及病理类型均无关(P>0.05)。见表1。

表1 TWIST1 mRNA及FSCN1 mRNA的表达与NSCLC临床病理特征的关系

3 讨论

TWIST1 mRNA在人类胚胎发育的过程中起重要作用，常通过与特定的DNA序列结合调控mRNA的转录从而发挥功能[6-8]。以往研究发现，TWIST1在胃癌中促进肿瘤细胞的上皮间质转化[9]；也有研究表明TWIST1在头颈癌的远处转移[10]以及胃癌的肿瘤耐药中发挥促癌作用[11]。本研究显示，TWIST1在NSCLC中异常高表达，且表达与患者的临床病理分期及有无淋巴结转移存在相关性，提示TWIST1可能与肿瘤的恶性生物学行为有关。此外，TWIST1与患者性别、年龄、吸烟史均无关，表明TWITST1在NSCLC中表达相对稳定，不受外界因素影响。而生存分析显示TWIST1与患者的总体生存期无明显相关，因此，TWIST1是否参与NSCLC远处转移、上皮间质转化及相关信号转导通路激活等还需进一步研究。

FSCN1在调节细胞骨架结构，维持细胞黏附，协调运动和侵袭等生物学途径中发挥重要作用[12]。近年来研究证实FSCN1在多种肿瘤中表达上调[13-14]，并且在霍奇金淋巴瘤及EB病毒相关淋巴瘤中可作为肿瘤标志物[15]，可作为胰腺导管腺癌预后和复发时间的预测指标[16]，能促进肿瘤细胞的免疫逃逸[17]。本研究发现FSCN1 mRNA在NSCLC中高表达并且与患者的预后相关，FSCN1 mRNA高表达患者其总体生存期低于低表达者。由此表明，FSCN1 mRNA可能在NSCLC的发生发展中起促癌作用，且能进一步影响患者预后。此外，相关性分析显示，TWIST1 mRNA与FSCN1 mRNA在NSCLC中表达呈正相关，提示TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA的功能可能存在交叉协同作用。但两者相关性较弱，其原因可能是TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA表达受到多种不同信号通路的调控。

综上所述，本研究发现TWIST1 mRNA和FSCN1 mRNA在肺腺癌中高表达并且与患者的临床病理分期及预后密切相关，二者呈弱相关。本研究未阐明TWIST1和FSCN1在NSCLC中的生物学作用及作用机制，有待进一步研究。