塞莱昔布对舌鳞癌细胞Cal-27 增殖的抑制作用

曹顺顺， 汪晓龙， 舒传继， 邵剑杰

鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院口腔科，湖北 黄石（435002）

舌鳞癌是头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，与口咽癌位列全身恶性肿瘤的第6 位［1-2］。舌鳞癌的发病原因尚未明确，但是研究表明，吸烟、嗜酒等因素与舌鳞癌的发生有关［3］。目前临床上对于舌鳞癌的治疗以手术为主辅以放化疗的综合治疗，但目前治疗效果有限，因此研究药物对于舌鳞癌的治疗作用对于舌鳞癌的防治具有重要意义。

塞莱昔布（celecoxib，CELE）是临床上常用的非甾体抗炎药物，是环氧合酶2（Cyclooxygenase Ⅱ，COX-2）的选择性抑制剂，具有显著的抗炎镇痛的作用［4-5］。大量研究表明CELE 对肝癌［6］、胃癌［7］、肺癌［8］、结肠癌［9］等多种恶性肿瘤具有抑制作用。美国FDA 已批准家族性结肠腺瘤性息肉病人口服COX-2 抑制剂塞来昔布，用于预防结肠癌发生［10］。目前关于CELE 抑制舌鳞癌增殖的研究报道较少，因此本实验探讨CELE 对舌鳞癌细胞Cal-27 增殖的抑制作用并探讨其作用机制，为CELE 防治舌鳞癌提供临床前研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人舌鳞癌细胞Cal-27 购自武汉大学中国典型培养物保藏中心细胞库。CELE（纯度＞99%，购自上海阿拉丁试剂有限公司，货号：C129279）；c-Myc、Cyclin D1、β-actin 上下游引物和探针由北京康为世纪生物科技有限公司设计并合成；抑癌基因PTEN（9188）兔单克隆抗体、p-AKT（Thr308）（13038）兔单克隆抗体、原癌基因c-Myc（5605）兔单克隆抗体、G1/S-特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1，2978）兔单克隆抗体、β-actin（4970）兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG 二抗（7074）等购自美国CST 公司。全波长扫描酶标仪（xMark）、蛋白转印系统、细胞计数器（TC20）、实时荧光定量PCR 仪（CFX96）等购自美国伯乐公司；化学发光成像分析系统（G：BOX，SYNGENE 公司，英国）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测CELE对Cal-27细胞的毒性 取对数生长期细胞，按4 000 个/孔，将Cal-27 细胞接种到96 孔板中，每孔体积为100 μL；设置空白组（无Cal-27，仅DMEM 培养基）、对照组（0 μmol/L）及不同浓度（10、20、40、60、80、100 μmol/L）的实验组，每组设置6 个复孔。酶标仪450 nm 波长处测定吸光度（A），计算细胞存活率［（A给药-A空白）/（A对照-A空白）× 100%］。

1.2.2 实验分组 取对数生长期细胞，以1 × 105个/孔接种于培养皿中，根据CCK-8 细胞毒性实验结果，设对照组（0 μmol/L）及CELE 实验组（10、20、40 μmol/L），每组设置3 个复孔。

1.2.3 Transwell 小室实验检测细胞的迁移 采用Transwell 6 孔板试剂盒检测细胞迁移能力，按照试剂盒的说明书要求，首先配置基质胶，与预冷的DMEM 培养基混合，均匀铺在Transwell 侵袭上室，37 ℃条件下孵育2 h，然后Transwell 上室每孔计入200 μL/孔不含血清的DMEM 培养液，Transwell 下室加入混有10%胎牛血清的DMEM，每孔500 μL。37 ℃的孵育箱孵育24 h，加入结晶紫染色试剂，孵育15 min，后用倒置光学显微镜观察并拍照。1.2.4 实时荧光定量PCR 检测c-Myc、Cyclin D1 的mRNA 表达水平 将生长状态良好的Cal-27 细胞接种于培养皿中进行分组给药，运用RNA 提取试剂提取Cal-27 细胞RNA，经过逆转录得到cDNA，然后运用实时荧光定量PCR 检测Cal-27 细胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表达水平。PCR 扩增条件（反应体系为20 μL）：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s，共40 个循环。以β-actin 作为内参，采用2-△△Ct方法计算相关基因mRNA 的相对表达量。引物序列如下：β-actin（330 dp）：正向：5′-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3′，反向：5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′；c-Myc（133 dp）：正向：5′-TCGGAAGGACTATCCTGCTG-3′，反向：5′-GTGTGTTCGCCTCTTGACATT-3′ ；Cyclin D1（218 dp）：正向：5′-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3′；反向：5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′。

1.2.5 Western blot 检测增殖相关蛋白的表达 Cal-27 细胞经不同剂量（10、20、40 μmol/L）CELE 给药作用24 h 后，以及经40 μmol/L 的CELE 给药作用6、12、24 h 后，加入蛋白抽提试剂提取Cal-27 细胞蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白含量。分别取Cal-27 细胞蛋白样品40 μg，经过Tris-HCl 凝胶电泳分离后，转至PVDF 膜（0.45 μm）上，5%脱脂牛奶封闭1 h后，蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）、磷酸化蛋白 激 酶B（phospho - protein kinase B，p - AKT）（Thr308）、原癌基因蛋白c-Myc、G1/S-特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）等一抗（1∶1 000）在4 ℃条件下摇床孵育过夜，TBST 清洗3 次，每次10 min，二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 显色后运用G：BOX 成像分析系统获得条带，以β-actin 作为内参。采用Image J 图像软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0 软件进行统计分析。计量资料采用均数± 标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CELE 对Cal-27 细胞增殖的抑制作用

运用CCK-8 细胞活力检测法检测CELE 对Cal-27 细胞的细胞毒性，结果如图1 所示。随着CELE给药浓度增大，Cal-27 细胞存活率依次降低，同一浓度给药时间增长，Cal-27 细胞存活率也随之降低。当CELE 浓度为60 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 细胞存活率分别为68.5%、60.0%，当CELE 浓度为40 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 细胞存活率为80.0%、75.0%，表明高剂量（＞40 μmol/L）CELE 对Cal-27 细胞具有明显的抑制作用，因此选择10、20、40 μmol/L 对细胞存活率影响较小的剂量作为CELE 的给药剂量进行下一步的研究。

2.2 不同浓度CELE 对细胞迁移的影响

Transwell 小室实验检测结果显示，细胞的迁移能力比较：对照组＞10 μmol/L CELE 组＞20 μmol/L CELE 组＞40 μmol/L CELE 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

Figure 1 CCK-8 assay to detect the effect of different concentration of CELE on the survival rate of Cal-27 cells图1 CCK-8 检测法检测不同浓度的CELE 对Cal-27细胞存活率的影响

2.3 不同浓度CELE 对c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表达的影响

结果如图3 所示，与对照组比，不同浓度CELE给药作用后c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表达水平均降低，且结果均具有统计学意义（F＝6.584、7.125，P＜0.05）。表明CELE 能够抑制c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表达从而对Cal-27 细胞增殖具有抑制作用。

2.4 不同浓度CELE 对增殖相关蛋白表达的影响

不同浓度CELE 给药作用后检测PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表达情况，与对照组比，不同剂量CELE 给药组的p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表达均下降，PTEN 的表达均上升（F＝6.103，P＜0.05），见图4。

检测40 μmol/L 的CELE 给药作用6、12、24 h后相关蛋白的表达情况，与对照组比，CELE 给药后随着时间的推移，p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表达逐渐下降，PTEN 的表达逐渐升高（F＝5.835，P＜0.05），见图5。表明CELE 能够激活PTEN 信号通路抑制p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等增殖相关蛋白的表达从而抑制Cal-27 细胞增殖。

3 讨 论

Figure 2 The effect of different concentrations of CELE on Cal-27 cell invasion（× 200）图2 不同浓度CELE 对Cal-27 细胞侵袭的影响（× 200）

Figure 3 The effect of CELE on c-Myc, Cyclin D1 mRNA expression in Cal-27 cells图3 不同浓度CELE 对Cal-27 细胞的c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表达的影响

Figure 4 Effects of different concentrations of CELE on the expression of cell proliferation related proteins PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells图4 不同浓度CELE 对Cal-27 细胞的细胞增殖相关蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表达的影响

Figure 5 Effects of 40 μmol/L CELE on the expression of PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells at different time图5 40 μmol/L CELE 作用不同时间对Cal-27 细胞的细胞增殖相关蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表达的影响

CELE 作为一种临床上用于抗炎镇痛的药物，研究表明其能够激活PTEN 信号通路抑制AKT 信号通路，对多种肿瘤具有抑制作用。本实验考察了不同浓度的CELE 对舌鳞癌细胞Cal-27 的抑制作用。研究结果表明，不同浓度的CELE 对舌鳞癌细胞Cal-27 均具有一定的增殖抑制作用，同时不同剂量CELE 作用24 h 及相同剂量CELE 作用不同时间均能够激活PTEN 从而抑制AKT 活化抑制c-Myc、Cyclin D1 的表达从而抑制舌鳞癌细胞Cal-27增殖。

PTEN 是机体内的抑癌基因，对肿瘤细胞增殖具有负调节作用［12］。研究表明在舌鳞癌中PTEN失活，具有促进舌鳞癌细胞增殖及抗凋亡的作用［13］。PTEN 失活能够使其下游AKT 磷酸化水平增加其中主要是p-AKT（Thr308）磷酸化水平增加从而激活AKT 信号通路，AKT 信号通路能够调节肿瘤细胞能量代谢、增殖、抗凋亡等相关信号通路促进肿瘤细胞增殖［14］。Li 等［15］研究表明过表达AKT 能够诱导形成肝癌，同时等研究表明沉默PTEN 基因的表达能够激活AKT 信号通路从而促进肿瘤的形成、发生和发展。c-Myc、Cyclin D1 是AKT 信号通路下游重要的增殖相关基因，c-Myc 能够参与介导细胞外的传入生物信号向细胞核内传递，调控细胞增殖和凋亡［16-18］。Liu 等［19］研究表明c-Myc 过表达能够诱导肝细胞恶性转化从而形成肿瘤。Cyclin D1 是影响肿瘤细胞周期的关键调控因子［20］。PTEN 失活能够激活AKT 信号通路从而调控c-Myc、Cyclin D1 的表达，对肿瘤细胞增殖及恶性转化具有重要作用。

综上所述，CELE 作为一种临床上广泛应用的抗炎镇痛药物对舌鳞癌细胞Cal-27 增殖具有抑制作用，表明CELE 对于防治舌鳞癌具有一定的应用研究价值。