顺铂联合小檗碱通过诱导DNA损伤和ROS依赖性凋亡抑制肺癌细胞A549的生长

毛娟娟，程伟松，杨亦德，金 茜，汪佳兵

(台州市立医院 1.感染科、2.泌尿外科、3.药剂科，浙江 台州 318000)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤之首。由于早期缺乏常规检查，多数患者被确诊时已处于中晚期阶段，很难通过手术完全根治[1]。经典的细胞毒性药物仍然是临床上治疗肺癌的主要选择。在这一系列的细胞毒性药物中，顺铂为代表的铂类药物是常见的化学治疗药物[2]。顺铂是目前临床上治疗肺癌的一线化学治疗药物，能够诱导DNA损伤，抑制肺癌细胞生长[3]。然而，顺铂会损害正常细胞，导致严重的副作用，从而限制了其临床疗效[3]。为了降低顺铂的副作用，肿瘤学家根据经验开发了联合化疗方案。小檗碱(berberine，BBR)是从中药黄连根茎中提取的一种异喹啉类生物碱，研究发现BBR具有抗微生物和抗炎等多种药理活性[4]。目前，研究表明BBR对肝癌、前列腺癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、白血病和乳腺癌等表现抗肿瘤作用[5]。目前BBR对肺癌的研究有部分报道，但顺铂联合BBR对肺癌的抗肿瘤作用和机制尚无报道。因此，本文主要研究顺铂联合BBR体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能存在的抗肺癌作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人肺癌A549细胞，购自于上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2药物与试剂 顺铂(货号：P4394，Sigma公司)；小檗碱和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)(货号：B107342和A105422，上海阿拉丁有限公司)；MTT、结晶紫、Triton X-100、多聚甲醛、DCFH-DA和DAPI(上海碧云天生物技术有限公司)；PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)和0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)和胎牛血清(Gibico公司)；AnnexinV binding buffer、FITC AnnexinV Apoptosis及PI染色液(BD Biosciences Clontech)；γH2AX、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3和GAPDH(Cell Signaling Technology)。

1.1.3仪器 Spectra Max M2多功能酶标仪(Molecular Device公司)；CO2培养箱(Thermo美国热电集团)；倒置显微镜(日本尼康公司)；低温高速离心机(Thermo美国热电集团)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司); 细胞流式仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人肺癌A549细胞用含90% RPMI 1640培养基，10%胎牛血清，100 U·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素培养。所有进行实验的细胞复苏后传代应少于20代，且置于37 ℃、5% CO2的恒温二氧化碳细胞培养箱中。

1.2.2MTT检测A549细胞活力情况 取100 μL对数生长期A549细胞接种于96孔板(细胞数约每孔8 000个)，置于37 ℃细胞培养箱中培养过夜，以让细胞贴壁。次日更换新鲜培养基，加入不同浓度的BBR(0、3、6、12、25、100、200 μmol·L-1)， BBR(8 μmol·L-1)与不同浓度的顺铂(0、2.5、5、7.5、10、15 μmol·L-1)，并且设置DMSO为阴性对照组。24 h后每孔加20 μL MTT。4 h后每孔再加150 μL DMSO，酶标仪波长设置为490 nm测得OD值。生存率/%=给药组OD/阴性对照组OD值×100%。

1.2.3细胞集落实验检测A549集落形成情况 取对数生长期A549细胞1 mL分别接种到6孔板中，每孔含5×105个细胞，放入细胞培养箱中培养过夜。次日更换新鲜培养基，设置对照组、BBR(8 μmol·L-1)组、顺铂(10 μmol·L-1)组和(BBR+顺铂)组。用正常培养基培养细胞约8 d。用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，加入结晶紫染色液，用PBS清洗5次，并用相机拍照获得图像。

1.2.4流式细胞仪检测A549细胞凋亡情况 取对数生长期A549细胞，1 mL接种到6孔板中，每孔含5×105个细胞，放入细胞培养箱中培养过夜。次日更换新鲜培养基，设置对照组、BBR(8 μmol·L-1)组、顺铂(10 μmol·L-1)组和(BBR+顺铂)组。加NAC组(5 mmol·L-1)需要提前孵育1 h再加药，六孔板置37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h。收集细胞上清液，用PBS洗1次，用0.5 mL胰蛋白酶(不含EDTA)消化细胞，1 100 r·min-1离心4 min，弃上清用1 mL PBS重悬细胞，洗涤，1 100 r·min-1离心4 min，弃上清用 Binding buffer重悬细胞，加入至流式管中。每个流式管避光加入Annexin V，染色10 min后，再加PI染色5 min，然后加入Binding Buffer，最后用流式细胞仪进行收集检测。

1.2.5免疫荧光检测A549细胞DNA损伤情况 取对数生长期A549细胞，将每孔约1×105个细胞置于免疫荧光小皿中至细胞贴壁，弃去旧培养液，设置对照组、BBR(8 μmol·L-1)组、顺铂(10 μmol·L-1)组和(BBR+顺铂)组，作用时间为12 h。用预冷PBS洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗3次，每次3 min；0.5% Triton X-100室温通透10 min，PBS洗3次，每次3 min；在小皿中滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；弃封闭液，不洗，每个小皿滴加足够量一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜； PBST洗3次，每次3 min；加荧光二抗湿盒中室温孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，对细胞进行染核，PBST洗3次，每次3 min；加入抗荧光猝灭剂，倒置荧光显微镜拍照。

1.2.6流式细胞仪检测A549细胞内ROS情况 取对数生长期A549细胞1 mL，含5×105个细胞，分别接种到6孔板中，放入细胞培养箱中培养过夜。次日更换新鲜培养基，设置对照组、BBR(8 μmol·L-1)组、顺铂(10 μmol·L-1)组和(BBR+顺铂)组。弃上清培养基，用PBS洗1次，用饥饿培养基比例为1 ∶ 2 000稀释加入DCFH-DA荧光探针，在细胞培养箱中孵育30 min，吸掉探针染色液，PBS洗涤，胰酶消化，加入培养基收集细胞。1 100 r·min-1离心3 min，弃上清用 PBS重悬细胞，1 100 r·min-1离心3 min，吸掉离心后液体，再加入PBS重悬。最后用流式细胞仪进行收集检测。

1.2.7Western blot法检测A549细胞内相关蛋白表达 取对数生长期A549细胞1 mL，含5×105个细胞，分别接种到6孔板中，放入细胞培养箱中培养过夜。次日更换新鲜培养基，设置对照组、BBR(8 μmol·L-1)组、顺铂(10 μmol·L-1)组和(BBR+顺铂)组。弃上清液，加入PBS洗涤，加入细胞裂解缓冲液，摇匀后放在冰上裂解5 min，用蛋白刮刀刮取蛋白混悬液并收集在预冷的EP管中。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,测定蛋白浓度，制蛋白样品。取蛋白，凝胶电泳，转膜90 min。用5 %牛奶封闭1.5 h；用0.1% TBST洗膜3次，加入适当比例稀释的一抗，4 ℃摇床过夜；用0.1% TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床孵1 h；用0.1% TBST洗膜3次，在ECL孵育显影凝胶成像系统中成像。

2 结果

2.1 顺铂联合BBR增强抑制A549细胞增殖如Fig 1A所示，相对于对照组，BBR能够浓度依赖性地抑制A549生长(P<0.01)。同时，我们发现当8 μmol·L-1的BBR与不同浓度的顺铂联合后也呈浓度依赖性地抑制细胞生长(P<0.01)。其中，进一步实验表明，BBR(8 μmol·L-1)与10 μmol·L-1的顺铂联用可显着提高细胞毒性，细胞抑制率达到80%(Fig 1B)。因此，选择8 μmol·L-1的BBR与10 μmol·L-1顺铂作为A549细胞联合作用的浓度。

2.2 顺铂联合BBR增强抑制A549细胞集落形成细胞集落实验发现，相对于对照组和单药组，联合组能有效抑制A549细胞集落的形成(P<0.01)(Fig 2)。

2.3 顺铂联合BBR增强诱导A549细胞凋亡流式细胞术实验发现，相对于对照组，8 μmol·L-1的BBR和10 μmol·L-1顺铂均能诱导A549细胞凋亡，其中凋亡率分别为25.2%和15.2%。但当两药联合作用后，能明显提高A549细胞的凋亡，凋亡率达到41.2%(P<0.01)(Fig 3A，3B)。为了进一步说明联合后对细胞凋亡的影响，Wwestern blot检测Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达。结果表明，相对于单药组，联合作用后能明显抑制Bcl-2的表达和提高cleaved-caspase-3的表达(Fig 3C,3D)。

Fig 1 Effect of cispaltin combined with BBR on

**P<0.01vscontrol group

2.4 顺铂联合BBR增强诱导A549细胞的DNA损伤为进一步说明两药联合后的抗肿瘤机制，本实验对诱导DNA损伤进行研究。结果如Fig 4A，4B，相对于对照组和单药组，联合作用后能明显提高γH2AX蛋白的表达(P<0.01)。同时，相应的免疫荧光实验也发现，顺铂和BBR联合作用后，能够明显提高γH2AX聚焦，见Fig 4C。

2.5 顺铂联合BBR增强A549细胞内ROS水平流式细胞术实验进一步发现，如Fig 5A,5B，相对于对照组和单药组，两药联合作用后能明显提高细胞内的ROS水平(P<0.01)。

2.6 顺铂联合BBR升高ROS促进A549细胞凋亡为了说明联合用药后升高的ROS能够增强A549细胞凋亡，细胞流式术实验发现，相对于对照组和单药组，顺铂联合BBR明显提高细胞凋亡率。但当两药联合ROS清除剂NAC后，细胞的凋亡率明显下降(P<0.01)(Fig 6A,6B)。并且，Western blot实验也表明，相对于联合组，使用NAC能够提高Bcl-2的表达和降低cleaved-caspase-3的表达，说明了ROS介导顺铂联合BBR的抗肿瘤作用(Fig 6C，6D)。

**P<0.01vscontrol group

3 讨论

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤之首，全球范围内，肺癌发生率不断上升，危害日益严重，给人们的健康带来了越来越多的压力[1]。由于缺乏有效的早期诊断方法和明显的早期症状，大多数肺癌患者被确诊时已经处于晚期，不能通过手术切除等手段治疗，化疗是他们最主要的临床治疗策略[1]。目前随着各种癌症特异性分子生物标志物的发现，针对肿瘤特异性靶点的个体化治疗逐渐成为肺癌药物的开发热点[5]。但靶向治疗过程中不仅频繁出现耐药性，而且靶向药物的治疗费用昂贵，这导致了靶向治疗的受限[6-7]。另外，对于一些没有潜在可行的分子靶点的肺癌患者，靶向药物也不能用于治疗[8-9]。因此，经典的细胞毒性药物已经成为靶向治疗受限及无效患者的首选。然而，细胞毒性药物如顺铂具有胃肠道反应、肝功能不全、肾衰竭、心血管并发症等不良反应[3]。因此，为了降低细胞毒性药物的副作用，联合用药是目前研究的热点。

在本文中，我们探讨顺铂和BBR联合后对人肺癌A549细胞的抗肿瘤作用及相应的抗肿瘤机制。我们初步使用MTT实验研究联合用药对A549细胞生存率的影响。结果表明，联用相对较低剂量的BBR和顺铂可增强对A549细胞的细胞毒性作用。细胞集落形成实验发现联合能有效降低A549细胞集落的形成。细胞凋亡是基因介导的程序性细胞死亡方式之一，对于消除各种生物系统中的有害细胞至关重要，并且是细胞毒性药物的关键抗肿瘤机制[10]。我们的研究表明，相对于对照组和单药组，顺铂和BBR联合后能有效地诱导A549细胞凋亡。Bcl-2和caspase-3被公认是在肿瘤发生中起重要作用的凋亡相关基因。本研究的Western blot结果表明，相对于单药组，两药联合能够明显抑制Bcl-2的表达，同时提高cle-caspase3的表达，说明顺铂联合BBR后通过增强相关凋亡蛋白的表达起到协同作用。

研究表明，顺铂是细胞周期非特异性药物，能够诱导DNA损伤从而促进肿瘤细胞死亡。同时，相关报道发现，BBR也能够直接与DNA结合后干扰DNA复制，从而诱导细胞死亡[11]，因此，BBR联合顺铂可能通过增强DNA损伤，从而促进A549细胞死亡。γH2AX是DNA双链断裂的标记物，在识别细胞内DNA损伤、保持相关基因组的完整性和稳定中发挥着至关重要的作用[12]。本文研究表明，BBR与顺铂联合能够增强γH2AX蛋白的表达，免疫荧光实验也发现联合组的γH2AX荧光亮度增强。以上结果说明。BBR能够增强顺铂对A549细胞内DNA的损伤，这或许是BBR增敏顺铂抗肿瘤的机制之一。

**P<0.01vscontrol group

研究发现，氧化应激与癌症的发生和发展密切有关[13]。其中，高水平的ROS能够损伤脂质、蛋白质和DNA，最终导致肿瘤细胞死亡[13]。同时，肿瘤细胞内ROS的水平明显高于正常细胞，这使得肿瘤细胞更加依赖抗氧化系统来维持自身的氧化平衡状态，也使得肿瘤细胞对ROS的上升更为敏感，故通过升高肿瘤细胞内ROS的水平能够在对正常细胞损伤较小的情况下，选择性杀伤肿瘤细胞[14]。本研究发现，顺铂和BBR联用后明显提高A549细胞内ROS水平。这与Youn等[15]报道顺铂和BBR联用后提高Hela细胞内ROS水平结果一致。我们也发现在联合使用NAC后，ROS被明显降低。相应的细胞流式实验也表明，在使用NAC后，顺铂和BBR联用后A549细胞的凋亡率明显降低。Western blot实验也发现，相对于联合组，使用NAC能够有效提高Bcl-2的表达和降低cleaved-caspase-3的表达，以上结果都说明了ROS参与顺铂联合BBR的抗肿瘤作用。

综上所述，本研究表明，顺铂和BBR联合后协同抑制A549细胞的生长，此作用主要与增强细胞凋亡、诱导细胞内DNA损伤和提高细胞内的ROS水平有关。但目前本文主要在细胞层面上研究顺铂和BBR的联合抗肺癌作用，需要进一步在动物实验探索顺铂和BBR联合的抗肿瘤作用和机制。

**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Effect of cispaltin combined with BBR on ROS formation of A549 **P<0.01 vs control group

**P<0.001vscontrol group;##P<0.01vscispaltin+BBR group