基于分子对接和网络药理学技术预测银翘解毒合剂防治新型冠状病毒肺炎的可行性△

许洪波，刘妍如，周瑞，于金高，杨宁娟，王梅，黄峰，宋忠兴，唐志书*

1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化省部共建协同创新中心/ 秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)/陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083；2.陕西中医药大学 附属医院 国家中医临床研究基地，陕西 咸阳 712000；3.陕西中医药大学 制药厂 陕西省博士后创新基地，陕西 咸阳 712083

2019年末至今，一场由新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)肆虐全球，目前全世界已有数万人被2019-nCoV感染。该病毒是迄今第7种可感染人类的冠状病毒，其引发的重症病例和病死率较高[1-3]。目前为止还没有针对2019-nCoV的特效药；因此，根据冠状病毒结构及其致病机理寻找高效、低毒、靶向的药物，是目前中国和国际医药界的当务之急。

中医的整体观念与辨证论治特点在历次新突发传染病的防治中均发挥了独特作用[4-6]。从中医的角度分析，此次COVID-19可归于温病范畴，因其传染性较强，又属温疫[7]。在数千年中华文明史上，中医药学对于瘟疫诊治已积累了丰富的临床经验，形成了卫气营血辨证、三焦辨证以及六经辨证等多种辨证论治理论体系[7]。中医治疗的优势是即使不明确病原体，仍然可以在辨证论治理论的指导下，根据许多既定的证候类型，参照传统的理法方药进行治疗。基于中医药在新突发传染病防治中的独特作用，国家卫生健康委将中医治疗纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，并提出了该病的中医病因、病机和治则。经过近1个月的临床实践证明，中医药对治疗此次COVID-19确实有疗效[5]。

分子对接技术是一种重要的计算机辅助药物分子设计手段，它通过化学计量学方法研究蛋白质受体和药物分子之间空间、能量和化学环境匹配情况，可阐明和预测药物的作用效果和机制[9]。近年来，分子对接技术已成为中药研究领域的一项常用技术[10-11]，特别是对中药药效物质基础的高效、快速筛选研究有重要意义。网络药理学整合了系统生物学、多向药理学(polypharmacology)、计算生物学和网络分析等学科，从整体角度探索中药与疾病间的关联性，契合于中药多成分-多靶点的作用关系，与中药从整体水平调控机体并发挥治疗作用的观点相吻合，从而提供了一种从系统水平探寻中药及其复方潜在活性成分的新策略[3]。

本研究运用分子对接和网络药理学技术研究银翘解毒合剂防治病毒性肺炎可能的物质基础和起效路径，为银翘解毒合剂用于COVID-19的防治提供参考。

1 方法

1.1 银翘解毒合剂所含化学成分收集

使用计算系统生物学实验室平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/)、Collective Molecular Activities of Useful Plants(CMAUP，http：//bidd2.nus.edu.sg/CMAUP/)及PubChem数据库，分别收集金银花、连翘、桔梗、荆芥、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、淡竹叶和甘草中已报道的化学成分。

1.2 分子对接

以银翘解毒合剂中的成分为配体，以血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)蛋白为受体，进行分子对接虚拟筛选，对接主要通过Discovery Studio (DS)软件完成。

1.2.1对接受体的准备 本研究蛋白靶点ACE2 的晶体结构获取自RCSD蛋白质数据库 (PDB：2ajf)，并按照以下步骤对蛋白晶体进行预处理：1)删除水分子、原配体分子及非相关的蛋白质构象；2)经Prepare Protein工具处理；3)基于文献报道的该受体可能结合域定义结合位点Sphere；4)保存备用。

1.2.2配体的准备 将所收集的成分结构去重后，保存成sd格式文件，导入DS软件中，运行Prepare Ligands工具，对配体加氢、生成优势构象，保存结构备用。

1.2.3分子对接 分别打开准备的受体和配体文件，按照DS软件对接流程进行分子对接。LibDock对接参数设置为：Docking Tolerance 0.25，Max Hits to Save 100，Conformation Method FAST，其他参数为默认设置。从对接结果中选取Docking打分函数LibDockScore得分最高者，分析其相互作用。CDOCKER对接参数设置为：Top Hits 10，Dynamics Steps 1000，Dynamics Target Temperature 1000，Maximum Bad Orientations 800，Orientation vdW Energy Threshold 300，Heating Steps 2000，Heating Target Temperature 700，Cooling Steps 5000，Cooling Target Temperature 300，Forcefield CHARMm。

传统的教学模式是学生在教室里“群体”听课，教师讲解的难易程度与学生所能接受的程度常常不能完全一致。领悟快的学生听了一次课就掌握了新知，上课走神或领悟慢的学生则会出现听不懂的现象，因此，只能尽量保证大部分学生的学习，很难做到让每一位学生都听懂且掌握。

1.3 关键活性成分及其靶标蛋白的筛选

中药多为口服制剂，在体内需经过吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)过程到达靶点器官、组织发挥作用，即ADME过程。其中口服生物利用度(OB)是药物ADME过程中重要的药动学参数之一，它表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并吸收的速度与程度。此外，化合物类药性(DL)是指化合物与已知药物的相似程度，DL≥0.18则认为该化合物与Drugbank数据库里药物具有一定的相似性。因此，为了从银翘解毒合剂活性化合物群中筛选到关键活性成分，设定OB≥30%，DL≥0.18作为阈值进行过滤筛选，获得关键活性成分，并通过TCMSP、Drugbank等数据库获取相关靶标蛋白。

1.4 关键活性成分-靶点网络构建与分析

将筛选得到的银翘解毒合剂中关键活性成分及其对应的靶标，导入 Cytoscape 3.7.2软件，构建活性成分-靶点网络，利用Cytoscape软件的Network Analyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(Degree)、介数(betweenness centrality，BC)等。

1.5 靶点生物学功能富集分析

通过R软件包中的Cluster profiler模块对关键成分的潜在作用靶点进行GO (Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析，以P<0.05为指标对结果进行筛选分析，使用R语言对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 成分收集

通过网络数据库收集到金银花、连翘、桔梗、荆芥、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、淡竹叶和甘草中的成分结构分别为236、150、102、164、144、15、19、280个，共计1269个化合物，去掉重复结构后共有1060个化合物。

2.2 分子对接结果

将收集的1060个中药成分，以ACE2为靶蛋白，进行分子对接。计算结果表明：银翘解毒合剂中化合物的LibDockScore得分最大值为221.368，得分排名前10的化合物分别为：去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3(deapio-platycodin-D3)(221.368)、远志皂苷D2(polygalacin D2)(211.283)、3′-α-O-远志皂苷D(3′-α-O-polygalacin D) (208.178)、连翘种苷B(suspensaside B)(194.921)、桔梗皂苷G1(platycoside G1) (186.793)、连翘酯苷B(forsythoside B)(183.393)、3′-O-远志皂苷D(3′-O-polygalacin D)(182.998)、甘草糖苷E(licorice glycoside E)(178.568)、连翘脂苷C(forsythoside C)(178.038)、连翘属苷(forsythiaside)(176.095)。所有参与分子对接的成分中，有18个化合物的LibDockScore值比参照药物洛匹那韦高 (LibDockScore>165.002)，有40个化合物比瑞德西韦高(LibDockScore>152.993)(见表1)。此外，共有301个成分的LibDockScore值>100(LibDock分子对接的打分函数LibDockScore是基于配体与受体对接时的亲和力、相对能量和对接模式等进行综合打分，一般认为LibDockScore>100即表明受体与配体结合较好，其值越大则表明对接产生的复合物构象越稳定，配体与受体的亲和作用越好[12])。

表1 LibDock分子对接排名前40的化学成分

注：—表示未进行CDOCKER研究。

为进一步评估和验证这40个化合物与ACE2蛋白的作用，我们采用CDOCKER方法对其进行研究。CDOCKER是基于CHARMm力场的分子对接方法，它采用高温动力学搜索配体分子的柔性构象，进而针对各配体构象用模拟退火的方法优化其与受体活性位点的作用，这种方法可以产生高精度的对接结果。CDOCKER实验结果表明，这40个化合物的-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值均为正数，且该值基本都高于参照化合物洛匹那韦(48.210 kcal·mol-1)和瑞德西韦(43.005 kcal·mol-1)，提示这些化合物与受体蛋白具有较好的亲和作用。

2.3 结合模式分析

根据上述分子对接结果，对表1中LibDockScore得分最高的2个化合物去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3和远志皂苷D2与ACE2蛋白对接的作用模式进行分析。ACE2蛋白与这2个化合物相互作用的2D和3D图见图1。由图可知，2个配体均结合于ACE2蛋白的空腔内，且与受体之间主要通过氢键作用稳定结合。所不同的是，去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3可与受体蛋白中ASN394、LYS562、GLY395、ARG514、ASP206、TYR515、ARG518、HIS374、GLU398残基形成氢键作用，产生稳定结合。远志皂苷D2主要与受体蛋白中TYR202、ASP206、LYS562、GLY395、GLU398、ARG514残基形成氢键作用，其他残基如TYR510、HIS378等，可与配体形成较强的疏水堆积作用，有利于其结合。

2.4 银翘解毒合剂抗冠状病毒的关键活性成分筛选

上述通过分子对接筛选得到的潜在活性化合物，尽管有较高的LibDockScore值，但通过检索发现，很多成分的OB和DL较差。

注：A.去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3与ACE2蛋白结合3D模式；B.去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3与ACE2蛋白相互作用2D图；C.远志皂苷D2与ACE2蛋白结合3D模式；D.远志皂苷D2与ACE2蛋白相互作用2D图。图1 代表性化合物去芹菜糖基-桔梗皂苷-D3和远志皂苷D2与ACE2蛋白作用模式

因此我们根据系统药理学通用的活性成分筛选标准(OB≥30%且DL≥0.18)[3-5]，借助TCMSP数据平台，从LibDockScore得分>100的成分中筛选出符合标准的化合物，建立关键活性成分集合。最终从301个成分(LibDockScore>100)中筛选到关键活性成分55个，详细信息见表2。

表2 银翘解毒合剂中潜在抗冠状病毒的关键活性成分

续表2

2.5 关键活性成分-靶点网络构建与分析

通过PubChem、TCMSP等数据库检索，收集整理55个关键活性成分的相关靶点123个。运用Cytoscape软件构建银翘解毒合剂关键活性成分-靶点网络，见图2。图中共包含166个节点和502条边线，其中化合物节点43个(12个化合物未参与网络构建)，蛋白靶点节点123个。该网络拓扑学性质分析表明：平均每个化合物与11.67个靶点相互作用，每个靶点平均与4.08个化合物相互作用，因此在银翘解毒合剂中也存在多个化合物同时作用于同1个靶点且单个化合物又作用于多个靶点的现象。从化合物角度来看，有7个化合物(16.28%)的作用靶点超过20个，分别为芦丁、β-谷甾醇、豆甾醇、4′-甲氧基光甘草定、新疆甘草紫檀素(shinpterocarpin)、粗毛甘草素C和β-胡萝卜素。从靶点的角度来看，有6个靶标(4.88%)的Degree≥20，有18个靶标与不少于10个化合物相互作用，其中等级值排名前5的靶标为：PTGS2(Prostaglandin G/H synthase 2)、NCOA2 (Nuclear receptor coactivator 2)、HSP90AA1 (Heat shock protein HSP 90)、PCP4 (Calmodulin) 和F7 (Coagulation factor VII)；其中大部分靶点蛋白能够调控炎症、细胞凋亡以及免疫反应等生物过程。

注：绿色菱形节点为关键活性化合物；蓝色方形节点为靶点。图2 银翘解毒合剂中潜在抗冠状病毒的关键活性成分-靶点网络

2.6 关键活性成分作用靶点生物学功能分析

为深入了解上述关键化合物作用靶点的生物学功能，对这些靶点进行了GO 富集分析与KEGG通路分析。GO富集分析得到了P<0.05的GO条目共计2080个，其中包含生物过程(biological process，BP)条目1862个，细胞组成(cell composition，CC)条目88个，分子功能(molecular function，MF)条目130个，各类别前20的条目分别见图3～5。

KEGG通路分析得到了P<0.05的通路152条(前20条通路结果见图6)，其中富集的主要通路包括了与COVID-19感染源类似(病毒感染)的疾病，如卡波济氏肉瘤疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒感染、A型流感病毒等；以及PI3K-Akt信号传导通路、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、IL-17信号传导通路、T细胞受体信号传导通路等已报道与肺炎和免疫反应、炎症反应相关的信号通路[13]。

图3 GO-BP富集分析结果

图5 GO-MF富集分析结果

图6 银翘解毒合剂中潜在抗冠状病毒的关键成分作用靶点KEGG通路富集分析

综合通路富集分析结果可知，从银翘解毒合剂中筛选出的关键活性成分可能对病毒感染以及肺部损伤有一定的作用。该结果与分子对接实验一致，可互为佐证，同时也揭示了银翘解毒合剂临床防治COVID-19可能的起效环节。

3 讨论

银翘解毒合剂处方源于温病名方银翘散；该方出自《温病条辨》，是吴塘 (鞠通) 论治温病所创，被誉为治疗温病第一方[14]，具有辛凉化湿、疏散风热、清热解毒之功效。该方以金银花、连翘为君药，既有辛凉透邪清热之效，又具芳香辟秽解毒之功；荆芥、豆豉辛温不燥能助君药透散表邪，又能防止寒性药物凉遏太过，而致表邪难解；薄荷、牛蒡助君药疏散风热，共为臣药；淡竹叶、芦根清热生津；桔梗、甘草宣肺利咽止咳，均为佐药，其中甘草调和诸药，兼为使药。银翘解毒合剂配伍具有内清热毒、外散风热、透解表邪之功，构成清疏兼顾之剂。该方主要针对温病初起卫分证及风热表证；温病初起，邪在卫分，卫气被郁，开合失司，则发热，微恶风寒，无汗或有汗不畅，风热袭肺以致咳嗽咽痛，温邪易伤津液，故口渴，舌尖红，邪在卫表，故舌苔薄自或薄黄。现代研究表明，该方用于治疗风热感冒、流感的疗效显著[15-16]。

COVID-19属于中医学温病范畴，病机为疫毒犯肺，起始邪在肺卫，入里化热为重要病机转归。此疾具有伏邪治病特点，疫毒伏藏体内，因人禀赋不同，可即刻起病，也可伏藏体内，殆至机体免疫功能低下而发病，具有湿、热、毒之性，临床治疗应化湿清解。COVID-19的发病特点、临床症状、中医证候及传变规律等与银翘解毒合剂所治诸症符合，因此，从中医理论方面来看，银翘解毒合剂的确可以作为防治早期新冠肺炎的首选方之一。同时我们认为，新冠肺炎进入危重期后，病情复杂，变证丛生，临床治疗上需要采取更加个体化的方式。

研究显示，2019-nCoV与感染途径一致，均通过其表达的S-蛋白与人体内ACE2结合，导致病毒侵入机体而致病[4，17-18]。重要的是，同源性建模表明2019-nCoV与ACE2受体的结合域与SARS-CoV结构相似，尽管它的受体结合域中存在氨基酸突变，多个氨基酸发生了变化，但变化后的氨基酸却在整体性上完美地维持了病毒S-蛋白与ACE2受体相互结合构象的稳定性[19-21]。因此，能作用于ACE2特异性位点的小分子，就有可能阻断2019-nCoV S-蛋白与宿主ACE2的结合，从而达到防治2019-nCoV的目的。为此，本研究主要针对2019-nCoV感染过程的关键靶蛋白ACE2，通过分子对接筛选银翘解毒合剂抗2019-nCoV的潜在分子。对接结果表明，银翘解毒合剂中有301个成分与ACE2蛋白具有较好的亲和作用，其中作用较好的化合物主要为桔梗中的皂苷和连翘中的酯苷等类成分。此前已有研究显示桔梗皂苷和连翘酯苷确有较好的抗呼吸道病毒作用[22-25]，提示虚拟筛选的结果与此前的实验结果具有较高的一致性。

基于对活性成分ADME性质的考虑，我们对虚拟筛选所得活性成分进行进一步筛选，从中得到关键活性成分55个，这些成分生物利用度较高、类药性较好，可能是银翘解毒合剂防治COVID-19的物质基础。为了探讨关键活性成分防治COVID-19的复杂路径，本研究采用网络药理学技术对关键成分及其靶标进行了深入挖掘和网络分析。从网络药理学分析结果可知，银翘解毒合剂中关键成分通过多成分、多靶点、多途径形式调控疾病；重要的是这些关键成分作用的通路包含了与COVID-19致病源类似的病毒感染性疾病，及与肺炎、免疫和炎症反应相关的信号通路；进一步表明这些关键成分可能对2019-nCoV有抑制作用、对COVID-19有防治作用；同时也佐证了分子对接的结果。

总之，本研究应用分子对接和网络药理学方法对银翘解毒合剂中防治病毒性肺炎的物质基础及可能起效环节进行了探讨。研究结果提示银翘解毒合剂用于COVID-19的防治具有一定的合理性。

但也应当注意，目前对病毒本身及感染治病机制认知尚存不足，计算化学生物学方法本身存在局限性等，因此可能会存在计算结果与实际临床疗效不符的现象；针对上述问题，可围绕物质基础-药效学-通路验证等开展实验研究，同时进行临床药效观察，为银翘解毒合剂防治COVID-19提供更坚实的依据。