探讨调控成年大鼠心肌细胞再生与调节性T细胞的关系

陆宏，陶杰，罗雪婷，黄宏波

昆明医科大学第一附属医院心血管外科，云南昆明 650032

心力衰竭是常见的一种危害人类健康的病症， 心肌细胞丢失是心力衰竭发生的根本原因， 这与人类的心肌细胞的实质有密切的关系[1]。 心肌细胞实质上是细胞的终末分化， 绝大部分人的心肌细胞在受到损伤后都不能通过迅速地增殖来得到恢复，因此，心力衰竭危害巨大。 目前治疗心力衰竭的最有效办法就是移植心脏， 但是有效的心源数量有限[2]。 而近年来，随着生活方式、环境等的改变， 因为心肌细胞受损而产生心力衰竭的患者数量正在急剧上升，心脏短缺的问题成为临床上的重要研究话题，研究能解决目前心力衰竭治疗中存在的问题方法具有重要的意义[3]。 再生医学是近年来新晋的一种医学模式，为心力衰竭患者的治疗提供了新的思路。 利用再生医学方法再生受损位置的心肌细胞成为心力衰竭治疗方法的主要研究方向， 是彻底解决心力衰竭患者困难的最有希望的方法[4-5]。 探讨心肌细胞具体的再生机制，创造出有效的治疗心力衰竭的治疗方法具有重要的意义， 该文以调节性T 细胞与成年大鼠心肌细胞再生的关系为主题， 进行了相关的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

该实验所用的大鼠均为北京市维通利华实验动物技术有限公司提供。 使用德国美天旎公司生产的大鼠心脏解离试剂盒，Abcam 生产的Western 印迹中Foxp3 抗体，Sigma 公司生产的Masson 染色试剂盒，R&D Systems 生产的免疫组化Foxp3 抗体， 北京中杉金桥生物技术有限公司生产的GAPDH 抗体， BD 生产的高速流式细胞分选系统FACSAria II ， Invitrogen 生产的Western 电泳仪，Zeiss生产的共聚焦显微镜、全自动扫片机。

1.2 方法

1.2.1 手术方法心尖切除手术： 研究组大鼠进行心尖切除术， 对照组大鼠进行假手术， 即手术操作均同研究组大鼠，只是不切除心尖。

1.2.2 测试法采用Western 印迹检测Foxp3， 然后利用流式细胞仪检测大鼠心脏的T reg 细胞数目， 主要检测CD25+、CD4+的细胞数目。 再测试T reg 细胞心肌再生能力之间的影响，在研究组大鼠的颈背部注入白喉毒素，连续为大鼠注射7 d，用免疫荧光染色检测法检测两组的抑炎因子（IL-10、IL-13、TGF-α）、转化生长因子（TGF-α、IL -1β）、促炎因子（IL-1β、IL-6）数目。

1.3 观察指标

观察两组术后14 dFoxp3、CD25+、CD4+数、 抑炎因子、转化生长因子、促炎因子数量。

1.4 统计方法

使用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料采用（±s）表示，进行t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组术后14 d Foxp3、CD25+、CD4+数比较

比较两组手术后14 d 的Foxp3 和CD25+、CD4+数，研究组的Foxp3 和CD25+、CD4+数明显多于对照组， 差异统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组术后14 d Foxp3、CD25+、CD4+数比较[（±s），%]Table 1 Comparison of the numbers of Foxp3, CD25+, and CD4+at 14 days after operation between the two groups[(±s)，%]

表1 两组术后14 d Foxp3、CD25+、CD4+数比较[（±s），%]Table 1 Comparison of the numbers of Foxp3, CD25+, and CD4+at 14 days after operation between the two groups[(±s)，%]

组别 Foxp3 CD25+ CD4+研究组（n=20）对照组（n=20）t 值P 值7.34±1.72 5.34±1.25 3.643 0.001 23.34±2.72 15.34±2.42 8.510 0.001 25.32±2.61 14.32±2.41 11.992 0.001

2.2 两组抑炎因子、转化生长因子、促炎因子比较

比较两组的抑炎因子、转化生长因子、促炎因子，研究组的抑炎因子和转化生长因子明显降低， 促炎因子明显上升，治疗后差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组抑炎因子、转化生长因子、促炎因子比较[（±s），pg/mL]Table 2 Comparison of two groups of anti-inflammatory factors,transforming growth factors,and pro-inflammatory factors[（±s），pg/mL]

表2 两组抑炎因子、转化生长因子、促炎因子比较[（±s），pg/mL]Table 2 Comparison of two groups of anti-inflammatory factors,transforming growth factors,and pro-inflammatory factors[（±s），pg/mL]

组别IL-10 IL-13 TGF-α IL-1β IL-6研究组（n=20）对照组（n=20）t 值P 值114.83±35.49 186.12±31.60 5.810 0.001 132.83±26.34 174.83±35.32 3.692 0.001 6.35±1.12 19.12±2.35 18.999 0.001 23.14±4.12 10.43±1.63 11.110 0.001 135.83±12.32 72.83±15.35 12.397 0.001

3 讨论

探讨解决心力衰竭的方法一直是医学界的重点话题，而再生医学的出现与继续研究为其提供了新的思路，该文立足这一点对这一问题进行了探讨。 根据相关研究报道，低等级的脊椎动物具有强大的心肌再生功能，如斑马鱼在切除20%的心尖组织后， 经过2 个月的时间就可以保证心肌功能恢复到原来的正常水平， 此后有研究报道，老鼠具有更快的心肌恢复功能，成为开展心肌再生研究的理想模型[5-6]。 调节性T 细胞免疫抑制炎症的功能在防治心血管方面疾病中有着重要的作用，有研究报道[7]，T细胞能增殖心肌细胞的再生功能， 能促进胚胎心肌细胞的增殖，在女性怀孕期间也能有同样的作用。 但是目前对于T 细胞和心肌再生功能方面的研究报道较少。 该文以这一问题为切入点， 研究T 细胞在心肌再生功能方面的作用。 该文以成年大鼠构建成年大鼠心尖切除再生型，进行了心肌细胞的再生功能和调节T 细胞的关系研究。

该文首先对研究组和对照组患者的T 细胞含量进行了比较， 研究组患者的Foxp3、CD25+、CD4+含量分别为（7.34±1.72）、（23.34±2.72）、（25.32±2.61），而对照组相应指标含量分别为（5.34±1.25）、（15.34±2.42）、（14.32±2.41），这证明T 细胞和大鼠的心肌再生功能紧密相关，T 细胞能增殖心肌细胞的再生功能，能促进胚胎心肌细胞的增殖，在王睿琪等[8]研究者的研究中，敲除TLR4 后，WT-control 组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+等值依次为 （25.3±0.8）%、（17.8±0.8）%、（1.43±0.06）%，WT-ISO 组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值依次为（29.1±1.0）%、（11.7 ±0.4%）、（2.49 ±0.11）%；WTISO-rHMGB1 组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值依次为 （33.3±0.8）%、（10.3 ±0.4）%、（3.22 ±0.13）， 表明T 细胞和心肌再生功能存在紧密联系，和该文研究结果相似。

研究者在调节性T 细胞对心肌再生功能的研究中的研究结果相似。 而后，为了进一步的明确T 细胞参与了心肌细胞的再生功能，该研究利用白喉毒素敲除了T 细胞，研 究 组IL-10、IL-13TGF-α、IL-1β、IL-6 含 量 分 别 为（114.83 ±35.49）pg/mL、 （132.83 ±26.34）pg/mL、 （6.35 ±1.12）pg/mL、（23.14±4.12）pg/mL、（135.83±12.32）pg/mL，对照 组 相 关 含 量 分 别 为 （186.12±31.60）pg/mL、（174.83±35.32）pg/mL、 （19.12 ±2.35）pg/mL、 （10.43 ±1.63）pg/mL、（72.83±15.35）pg/mL， 研究组的大鼠抑炎因子和转化生长因子明显降低，促炎因子明显上升，证明T 细胞功能缺失后，成年大鼠的炎症反应更为剧烈，心肌细胞的增殖功能受到明显抑制， 最终结局将是导致成年大鼠丢失心肌再生功能， 由此证明，T 细胞和心肌再生功能存在密切联系[9]。调节性T 细胞以Foxp3、CD25、CD4 为表型特征，是一组具有免疫抑制功能的T 细胞亚群，包括Treg 细胞、T 辅助细胞，与人体的免疫调节功能存在密切的关系。 可以通过IL -10、IL-35、TGF-β 等因子，抑制T 细胞活化[10-11]。此外，还能通过对IL-2 受体产生作用，增殖T 细胞的活化。 当敲除T 细胞后， 研究组的心肌增殖功能明显受限则证明了这一点，这和王睿琪等[8]研究者认为的T 细胞可调节心肌功能结果一致。

综上所述， 调节性T 细胞与成年大鼠的心肌细胞再生功能存在密切的联系， 对成年大鼠的心肌细胞有调控作用，能促进心肌细胞快速增殖，促进心脏修复，其细胞的数量和功能的强弱与成年大鼠体内的炎症反应呈反比，其调节功能减弱，大鼠体内的抑炎因子、转化生长因子将明显降低，促炎因子将明显上升，炎症反应加剧，最终导致大鼠的心肌细胞再生能力缺失。