松嫩草原盐碱土细菌多样性分析

向君亮，刘 权，申永瑞，王佳琦，张兴梅，王 鹏，殷奎德

(1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆163319;2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆163319)

土壤盐碱化是全球面临的主要环境问题之一。

据统计，世界上有约1/3的土地受到盐碱化影响，中国有367万 hm2盐碱地［1］，其主要分布于东北平原、华北平原、西北沙漠及沿海地区［2］。松嫩平原地处干旱-半干旱地区，是世界三大苏打型盐渍区之一，其受盐害土壤超过30万hm2。松嫩盐碱地不同于其他地方的特点是，其土壤中含大量的碳酸钠和碳酸氢钠，同时伴随着高pH值、高钠吸收率及表层土高度碱化［3］。由于受到化学性质的影响，土壤的物理性质变得很差，例如土壤粘度大，透气、透水性差等［4］。随着世界人口的日益增加和城市化进程的推进，耕地面积逐年减少，在这样的双重压力下，有效开发利用盐碱地资源，是维持农业的可持续发展，进一步挖掘盐碱化地区农业发展潜力的一条重要出路。

相比于磷脂脂肪酸法和PCR-DGGE法，高通量测序技术具有更多的优点，其测序深度高，可以检测到那些不可培养的微生物群落，能更加真实地揭示原位环境中微生物群落组成，因此，在研究环境微生物多样性中应用越来越广泛。Zhou等［8］利用高通量测序法研究了不同退化程度下青藏高原高寒草原土壤微生物群落的变化，结果发现青藏高原退化草原土壤中细菌群落以放线菌门为主，其次是变形菌门;牛世全等［9］发现，河西走廊盐碱土壤中变形菌门占主导地位，其余主要的细菌群落依次是放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门等9个菌门。本研究采用高通量测序技术对3种不同程度盐碱草原土壤细菌群落结构进行分析，旨在揭示不同盐度和碱度协同作用下的草原土壤微生物群落结构，对了解松嫩草原苏打盐碱土壤细菌群落结构的多样性及开发利用极端环境微生物资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样点位于黑龙江省大庆市一处未经人为破坏的盐碱草原(46°36＇23″N，125°10＇44″E)。根据植被密度和地面白色碱斑的程度，将其划分为3种类型:地表无白色碱斑，且植被生长茂盛的地块为轻度盐碱化土(SS);地表有少量白色碱斑，且有稀疏植被生长的地块为中度盐碱化土(MS);地表有大量白色碱斑，且无植被覆盖的地块为重度盐碱化土(HS)。2017年9月12日采样，每个类型土壤随机选取5个点，用铁锹采取地面0～20 cm土层深处土样，挑出枯草、草根及石块，混匀，装在无菌塑料袋中，置于干冰中运回实验室。将土壤分为两份，一份风干后用于土壤理化性质的测定，另一份于-80℃储存用于土壤微生物多样性测定。

1.2 植被覆盖密度统计

在草原上分别选取地表无白色碱斑，且植被覆盖度良好的地块以及地表有少量白色碱斑，且有稀疏植被覆盖的地块各5块，每块面积取0.5 m×0.5 m，统计样方内植被植株数量，求得平均值后换算为每平方米内植株数量。

1.3 土壤性质测定

土壤pH值、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质、碱化度、可溶性盐含量测定参照吕贻忠等［10］、姜海燕［11］方法进行，并稍加改进。

1.4 DNA提取与PCR扩增

采回的土样按照土壤基因组DNA提取试剂盒操作说明提取土壤细菌基因组总DNA，用NanoDrop 2000紫外微量分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量与完整性;利用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)扩增土壤细菌的16SrDNA的V4-V5区，扩增完成后以2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，利用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。

1.5 测序与分析

纯化后的PCR产物由深圳华大基因股份有限公司进行高通量测序。测序完成后，在生物信息学分析之前对原始数据进行处理，通过去除被适配器、模糊碱基污染的序列以便获得更准确和可靠的结果。使用FLASH和Trimmomatic软件对序列进行优化，方法和参数如下:(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置25 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后25 bp以下的reads，去除含N碱基的reads;(2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp;(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列;(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2;经过优化后的数据利用QIIME进行质控过滤以及OTU聚类，聚类相似度为0.97，聚类完成后在Silva数据库中进行比对，对各个样本的OTU在各分类等级上的群落组成进行注释。

2 结果与分析

2.1 植被覆盖密度调查

盐碱地面植物的覆盖与生长状况可以直接反映出土壤环境的好坏。通过对0.5 m×0.5 m样方内的植株数量进行统计，经换算后结果如图1所示。3种盐碱地的植被覆盖密度明显不同，轻度盐碱土地块(SS)植株数量最多，覆盖密度最大，为2 985株·m-2，中度盐碱土地块(MS)覆盖密度为880株·m-2，重度盐碱土块(HS)无植被生长。植被覆盖度的差异可能是由于土壤的pH值、含盐量及养分等因素造成的。

2.2 土壤理化性质分析

对土壤的理化性质及肥力指标进行了测定，结果如表1所示。土样SS的pH值为8.24，MS的pH值为9.52，HS的pH值为10.20，3种土样的pH值均大于8，是典型的碱土。随土壤盐碱化加重pH值逐渐增大，这可能与其含盐种类、含盐量及碱化度有关，也有可能是轻度盐碱土和中度盐碱土上有植物长期生长，植物根系分泌的有机酸及植物残体的分解降低了土壤的pH值。3个类型的土壤中，中度盐碱土的盐含量最高，达到1.43%，轻度盐碱土含盐量最低为0.30%。在碱化度上，随着盐碱程度的加重，碱化度也随之增加，重度盐碱土的碱化度最大，为84.59%，轻度盐碱土的碱化度为23.28%，碱化度均大于20%，为碱土。3种土样无论是在可溶性盐总量还是碱化度指标上均具有显著差异。在肥力指标方面，随着盐碱程度的提高，碱解氮、速效钾、有效磷和有机质的含量降低，轻度盐碱土的碱解氮、速效钾、有效磷和有机质含量最高，分别为303 mg·kg-1、402 mg·kg-1、20.3 mg·kg-1、32.70 g·kg-1，重度盐碱土各项肥力指标均为最低。

2.3 土壤微生物群落高通量测序分析

经过测序分析，3组土壤样品的稀释曲线如图2(a)所示，稀释曲线趋于平缓，说明测序趋于饱和，所取序列数能较为真实地反映出样本中的细菌群落。同时物种覆盖指数表明，测序数据能包含样品中99%以上的物种，能较好地反映出样品中的细菌群落组成，但仍然有少量细菌可能未被发现。

如图2(b)所示，3组样本共得到2841个OTU，其中 SS、MS和 HS组各有1462、1423、1030个 OTU;SS组中特有的OTU为914个，MS组中特有的OTU为565个，HS组中特有的OTU为476个。通过对各样本中的OTU数目进行分析后发现，3种不同盐碱程度的盐碱土OTU数目SS＞MS＞HS，说明轻度盐碱土的细菌类群最为丰富，重度盐碱土中细菌类群最少;SS组与HS组共有OTU仅为216个，说明这两组土壤的细菌类群一致性最低，差异较为明显。从整体来看，3种盐碱土各自特有的OTU数目占总OTU数的比例较大，虽然有一部分一致的细菌群落，但是三者之间的细菌群落差异还是较为明显，PCA分析也得到了一致的结果(图3)。

图1 不同盐碱地植被密度统计Fig.1 Vegetation coverage density in different saline-alkali land

表1 松嫩平原不同盐碱化土壤理化性质Table 1 Statistics of soil physical and chemical properties of Songnen Plain

图2 盐碱土壤样品稀释曲线与OTU数量韦恩图Fig.2 Rarefaction curve and Venn diagram of OTU number in saline-alkali soil samples

2.4 细菌群落结构分析

通过对3组盐碱土样细菌16SrDNA V4-V5区进行测序、比对后发现，共有39个菌门被检测出来(图4a)，其中SS组中检测到32个菌门，MS组检测到34个菌门，HS组中检测到31个菌门。酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、泉古菌门(Crenarchaeota)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)以及硝化螺旋菌门(Nitrospirae)为3种盐碱土壤中最主要的菌门。WS3、GAL15、GN04、LD1、NC10 为 SS 组特有菌门，Kazan-3B-28、WPS-2为MS组特有菌门。随着盐碱化程度的增加，泉古菌门的相对丰度从10.48%减少到1.25%，酸杆菌门的相对丰度也急剧下降，从SS组中的32.28%下降到MS组中的9.64%，但在MS与HS组中相对丰度差异不大。然而放线菌门和浮霉菌门的相对丰度却从7.74%、4.63%增加到22.57%、8.28%。拟杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度也有增加的趋势，分别从4.11%、4.10%增加到10.64%、18.80%，但是二者在MS和HS中的相对丰度差异不大。另外，变形菌门和绿弯菌门的相对丰度在MS组中最高，在HS和SS组中差异不大。

图3 样本主成分分析Fig.3 PCA of soil samples

在属分类水平上，除去未命名的菌属，共有12个菌属被鉴定出来，其中SS组7个，MS组11个，HS组11个，KSA1为HS组中特有菌属。热图分析表明(图4b)，SS和MS的微生物类群相似度较高，聚为一类。盐单胞菌属(Halomonas)、浮霉菌属(Planctomyces)、Rubricoccus的相对丰度与盐碱土的盐碱程度呈正相关，Candidatus_Entotheonella、Candidatus_Nitrososphaera的相对丰度与盐碱土的盐碱程度呈负相关，而土壤杆菌属(Agrobacterium)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、Euzebya、Pontibacter、Rubrobacter主要在MS组中聚集。SS组与MS组中相对丰度最大的菌属均为Candidatus_Nitrososphaera(10.43%、2.18%)，此外，Rubrobacter(1.29%)、Euzebya(1.51%)均为MS组中优势菌属;在HS组中相对丰度最大的菌属为KSA1(3.18%)，其他优势菌属还有Candidatus_Nitrososphaera(1.25%)、浮霉菌属(Planctomyces)(1.08%)以及盐单胞菌属(Halomonas)(1.37%)。

2.5 环境因子与菌群关联分析

RDA分析可以得到环境因子与样本分布和菌群结构之间的关系。本研究通过Canoco 4.5 For Windows软件对土壤理化因子对菌群结构的影响进行分析，理化因子包括可溶性盐(Soluble salt)、pH值、碱化度(ESP)、碱解氮(AN)、有效磷(AP)、速效钾(AK)和有机质(OM)含量，这些环境因子与细菌群落结构有着密不可分的关系。如图5所示，碱化度、可溶性盐含量、pH值与土壤的肥力因子(碱解氮、有效磷、速效钾和有机质含量)呈负相关，从环境因子与样本之间的关系来看，轻度盐碱土与土壤肥力因子呈正相关，与pH值、碱化度和可溶性盐含量呈负相关，而中度和重度盐碱土则与轻度盐碱土相反。环境因子与菌群结构的关系如图5(a)所示，这些细菌门类几乎被分成了4组，第Ⅰ组包括放线菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门在内的5个菌门占整个群落相对丰度的44.31%，它们的相对丰度与土壤pH值、碱化度呈正相关;第Ⅱ组包括酸杆菌门、泉古菌门、硝化螺旋菌门、广古菌门、TM7在内的5个菌门的相对丰度占总丰度的25.19%，它们的相对丰度与碱解氮、有机质以及速效钾含量呈正相关;而第Ⅲ组仅有疣微菌门和绿弯菌门，它们的相对丰度分别与有效磷含量和可溶性盐含量呈正相关。

环境因子与菌属的关系如图5(b)所示，这些细菌属被分成了3组，第Ⅰ组包括4个菌属，即盐单胞菌属、KSA1、浮霉菌属、Rubricoccus，其丰度与土壤的碱化度和pH值呈正相关;第Ⅱ组包括6个菌属，分别为土壤杆菌属、纤维弧菌属、尤泽比氏菌属、Gemmata、Pontibacter、红色杆菌属，其丰度与土壤的可溶性盐含量呈正相关;第Ⅲ组仅有 2个菌属，Candidatus Entotheonella和氨氧化菌属，其丰度与土壤有机质、碱解氮、速效钾等肥力指标呈正相关。

图4 不同盐碱土壤样品中细菌组成Fig.4 Relative abundances of bacteria in different saline-alkali soil samples

图5 土壤样品细菌群落与土壤理化因子相关性冗余分析Fig.5 Redundancy analysis biplot between the microbial communities and soil properties

3 讨论

盐碱土在我国分布较为广泛，但盐碱类型有所不同。东部沿海地区为氯化物盐土，华北和河套平原主要以氯化物与硫酸盐混合类型的盐碱土为主，然而东北松嫩平原、山西大同盆地的盐碱土主要以碳酸盐、重碳酸盐为主，因此也称苏打盐土［12］。本研究所采集的3种盐碱土pH值分别为8.24、9.52、10.20。王爽［13］在研究大庆地区重度盐碱土土壤性质时发现，土壤的pH值为10.52，含盐量为1.14%，碱化度为75.76%，与本研究所得结果相似。由于苏打型盐碱地有大量碳酸根和重碳酸根作用，即使土壤含盐量较低，其pH值也普遍较高。植物要在这样的环境下生存，不仅要避免因吸收过多Na+造成的钠离子毒害，还要耐受较高pH值所带来的碱胁迫作用。这种环境会导致植物根系腐烂，大部分植物难以生存。因此，3种盐碱地上植被密度也随着盐碱程度的加重而减少。

有机质、碱解氮、有效磷、速效钾是土壤肥力的重要指标。土壤酸碱性则是影响土壤肥力的一个重要因素。它不仅直接影响植物的生长发育，还影响着土壤对有机质的分解，营养元素的释放与转化，土壤离子的交换、运动、迁移和转化等［11］。盐碱土中由于含有大量盐分且pH值较高，所以土壤肥力较低。松嫩草原是我国典型的盐碱草甸草原，其土壤类型为黑土。黑土的有机质含量高，肥力较好，但随着盐碱程度的增加，动植物越来越难以存活，腐殖质的补给量急剧减少，由此造成土壤退化。本研究所采集的3种盐碱土中，SS组的盐碱土由于植被生长旺盛，植物残体补充了土壤中的腐殖质，然而随着盐碱化程度的增加，植被覆盖度越来越小，土壤中腐殖质的来源也急剧减少，因而有机质含量随之降低。

前人研究发现，土壤盐渍化程度越低，土壤细菌群落的多样性和丰富度越高［14］，本研究得出结果与其一致。随着盐碱浓度的增加，细菌群落结构差异显著，细菌丰度降低。导致土壤中细菌群落结构不同的因素有很多，例如土壤的理化性质对细菌和植物具有一定的筛选作用，其主要表现为高盐度对细胞的损害［15］。因此，随着土壤盐分的增加，只有耐盐性强的细菌或植物才能存活。动植物的残体以及植物的根分泌物等可以为土壤中细菌生存提供所需的营养物质。以往的研究表明，植物根系分泌物会引起根际土壤微生物群落的变化［16］。在本研究中，随着盐碱化程度的加重，土壤理化性质(养分、可溶性盐含量、pH、碱化度、酶活性等)与地上植被特征存在显著差异。没有植物可以在HS组的土壤中生存，土壤中缺乏植物残留物，可供细菌利用的营养物质较SS和MS组少，因此其丰度较低。由于营养物质的匮乏，一些需要丰富营养的细菌丰度低于SS组，如β-变形菌纲的细菌，这些差异导致了微生物群落结构和组成上的差异。本研究结果表明，随着土壤盐渍化程度的加重，土壤性质对微生物种群的影响越来越大，而在这种极端环境下能够存活的植物越来越少，可供微生物利用的有机物和根系分泌物等营养成分越来越少，因而细菌群落的结构发生了改变。

松嫩盐碱草地细菌群落以放线菌和变形细菌为主，这一结果与前人类似研究中的发现是一致的。放线菌由于其特殊的形态和细胞结构，能产生菌丝和孢子，抵抗外界的恶劣环境，因此广泛分布于各种生态环境中，特别是在极端环境中。MS组与HS组中放线菌的相对丰度明显高于SS组，说明放线菌能更好地适应极端环境。Tian等［17］研究发现，滨海盐碱土中最主要的细菌群落为放线菌门和变形菌门;Goordial等［18］应用宏基因组测序和活性测定研究大河流域多年冻土和新石器时代群落的功能容量，结果发现，这种极端环境下放线菌是最主要的菌门。Yergeau等［19］通过亚基因组测序、qPCR和微阵列分析发现，活性层土壤和永久冻土微生物群落结构非常相似，其中以放线菌为主。Zhou等［8］研究发现青藏高原退化草原土壤中细菌群落以放线菌门为主，其次是变形菌门。在本研究中，其他较为丰富的菌门还有酸杆菌门，绿弯菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门和厚壁菌门等，这些细菌在草地生态系统中具有重要的作用，例如降解动植物尸体，参与碳循环、能量循环过程。随着盐碱程度的增加，土壤中可供微生物利用的营养物质越来越少。Kuzenstol等［20］发现，多数γ变形菌纲的细菌为贫养菌，寡营养细菌有从大气中摄取营养物质的能力，可利用大气中的微量碳、氮源来维持正常的生长［21］。我们发现，芽单胞菌门、浮霉菌门及γ变形菌纲的相对丰度与土壤盐碱化程度成正比，然而一些富养菌的相对丰度(如β-变形菌纲)却随着土壤盐碱程度的降低而减少，这与Wang等［22］描述的相一致。

本研究发现，盐单胞菌属、KSA1、浮霉菌属、Rubricoccus的丰度与土壤的pH值和碱化度呈正相关。前人研究发现，盐单胞菌属细菌可以在细胞内积累高浓度阳离子以维持细胞内部的渗透平衡，还可以通过反向转运钠离子/钾离子，将细胞内过多的钠离子排至细胞外，同时增加钾离子和其他营养物的吸收维持细胞渗透压。孟琳［23］研究发现，肇东盐单胞菌(Halomonas zhaodongensis)NEAU-ST 10-25中存在的Na+/H+逆向转运蛋白基因可以明显增加大肠杆菌的耐盐能力。有研究表明，盐单胞菌属、Rubricoccus均为耐盐碱细菌［24］，而大多数耐盐碱细菌需要一定的盐浓度来维持细胞形态;因此，盐单胞菌属、Rubricoccus的丰度与土壤盐碱化程度呈正相关。

土壤微生物群落结构受到诸多因素的影响，除土壤理化因子外，温度、降水量、植被种类等均会影响其结构组成。由于黑龙江省冬季气候严寒，夏季炎热，年温差可达60℃，因此，在时间维度上与土壤细菌群落结构多样性的关系还有待于进一步研究。