微波炉烘干棉花叶片用于DNA 提取的效果分析

付小琼，李超，刘逢举，刘媛，彭军

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

植物DNA 的提取是开展分子生物学试验的基础，一般应用低温保鲜方法如液氮或冰袋保存植物叶片，防止DNA 的降解和氧化，但携带均不方便。近年来硅胶干燥法是研究人员贮藏植物组织时最常用的方法，效果较好[1-3]，但是一般需要干燥48 h，中间还需要更换干燥剂，操作比较麻烦。 目前急需1 种可以快速烘干植物叶片提取DNA 的方法。 本研究采用微波炉干燥叶片的方法处理新鲜棉叶，用干燥后的棉叶提取DNA 并开展了后续的试验，效果较好。

1 材料与方法

1.1 材料

棉花品种GK102 和石抗126 于2015 年种植于中国农业科学院棉花研究所东场（河南省安阳县白璧镇）试验地。

1.2 微波炉型号

微波炉为格兰仕集团产品，型号为G80F23N1PM8，微波炉的工作频率为2 450 MHz。

1.3 处理方法

分别用棉花平展子叶、未平展的真叶（未展真叶）、平展的嫩叶以及平展的成熟叶作为试验材料，用微波炉不同的火力烘干，低火烘10 min，中火烘6 min，高火烘4 min。

1.4 DNA 的提取方法及简单序列重复（Simple sequence repeat,SSR）引物检测

参考付小琼[4]方法进行DNA 的提取，稍加改进， 取干叶50 mg， 水浴时间延长至60 min 左右，DNA 烘干后溶解于100μLddH2O。所得DNA 用4 对SSR 核心引物（表1）扩增，检测DNA 扩增的效果。

表1 SSR 引物序列

1.5 DNA 质量检测

利用1%（质量分数，下同）琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计NanoDrop 2000 检测DNA 的质量浓度和纯度。

2 结果与分析

2.1 利用微波炉中火烘干真叶的试验结果

采集GK102 未展真叶、 平展嫩叶和平展成熟叶，在微波炉中用中火烘干后提取DNA。利用SSR引物NAU2026、CS62、NAU1042 和NAU1369 扩增带型见图1。 结果显示，未展真叶经微波炉中火干燥后提取的DNA 均不能扩增出目的条带；平展嫩叶和平展成熟叶经微波炉的中火干燥后提取的DNA 均能扩增出清晰的目的条带。 表明， 未展真叶不宜用微波炉烘干后提取DNA，而平展嫩叶和平展成熟叶经微波炉干燥后， 可以成功提取DNA。 为此， 平展嫩叶和平展成熟叶统称全展真叶，以区别于未展真叶，以下试验中真叶取样均为全展真叶。

图1 GK102 不同叶龄叶片烘干后DNA 的扩增情况

2.2 不同火力烘干处理棉花全展真叶的比较

采集GK102 全展真叶随机分为3 组， 分别用低火、 中火和高火烘干， 干燥后当天提取的DNA进行质量检测和SSR 扩增。 结果显示，引物一致性高，重复性好，且与棉花品种指纹图谱库的主带结果一致（图2）。 表明，棉花全展真叶可以在微波炉中经低火、中火和高火干燥；虽然OD260/OD280值偏高（表2），但不影响后续的SSR 分子鉴定试验。

表2 不同火力烘干处理下全展真叶提取的DNA 质量

图2 GK102 全展真叶不同火力烘干处理下的DNA 扩增带型

2.3 不同火力烘干平展子叶的比较

采集石抗126 的平展子叶， 随机分为3 组，分别用低火、 中火和高火烘干。 干燥后当天提取的DNA 检测结果见表3，扩增带型见图3。试验表明，棉花平展子叶在微波炉中经低火、中火和高火干燥后提取DNA，虽然OD260/OD280值偏高（表3），但不影响后续的SSR 分子鉴定试验。

表3 不同火力烘干的平展子叶提取DNA 的质量检测结果

2.4 烘干叶片保存1 周后的试验结果

干燥平展子叶和全展真叶分别装入2 mL 的离心管中密封，室温下放置1 周后，分别提取DNA 并进行检测，结果见表4。SSR 引物扩增后的图谱见图4 和图5。 表明，棉花平展子叶和全展真叶经微波炉干燥后放置1 个星期提取的DNA 的质量仍较好。

图3 引物CS62 扩增石抗126 平展子叶DNA 的带型

表4 烘干叶片后室温保存1 周后提取的DNA 质量检测结果

图4 石抗126 平展子叶烘干后1 周提取的DNA 经SSR 引物扩增结果

图5 GK102 全展真叶烘干后1 周提取的DNA 经SSR 引物扩增结果

2.5 鲜叶提取的DNA 质量与烘干全展真叶提取的对比

采集GK102 鲜叶200 mg 左右，用常规CTAB法[4]提取DNA 的质量浓度为1 621.5 mg·L－1，比烘干叶片（表2）高，OD260/OD280比值为1.91，处于正常范围，比烘干叶片低。

用1%琼脂糖凝胶电泳比较低火、 中火和高火分别干燥的全展真叶提取的DNA 和鲜叶片提取的DNA 结果（图6）显示，新鲜叶片提取的DNA 主带明亮，干燥叶片提取的DNA 主带较浅，表明新鲜叶片提取的DNA 量较大。 比较烘干叶片和新鲜叶片所得的图谱看出，烘干叶片提取DNA 的扩增图谱背景较黑，新鲜叶片提取的DNA 扩增图谱背景浅（图7），说明烘干叶片提取的DNA 中含有较多的杂质，但不影响试验的结果，不影响谱带的读取。

图6 干燥叶片和鲜叶片提取的DNA 样品琼脂糖凝胶电泳图谱

图7 GK102 干燥叶和鲜叶提取的DNA 的SSR 引物NAU1369 扩增结果

3 结论与讨论

未平展的棉花幼嫩叶片含水量高， 组织过嫩，经微波炉烘干后组织易被氧化破坏；试验中一般采集全展的真叶。 未平展的棉花嫩叶干燥后提取DNA 的SSR 引物扩增效果差，这与程中平等[5]用桃嫩叶研究结果是一致的。用微波炉烘干磨碎的叶片， 加入细胞裂解液后须适当延长65 ℃水浴时间至60 min， 所得DNA 需用离心机沉淀，DNA 得率较低。用微波炉不同的火力烘干平展子叶和全展真叶，均不影响DNA 的质量以及后续的SSR 分子检测工作；烘干时间短，仅需4～10 min。 烘干叶片的DNA OD260/OD280比值稍高于鲜叶， 但不影响SSR的分子检测试验。棉花平展子叶与全展真叶经微波炉干燥后提取的DNA 浓度和质量不受干燥后放置时间的影响。棉叶经微波炉烘干后可以密封室温放置、便于运输，且DNA 可随用随提，方便异地取样和携带。

一些基层育种单位不具备分子试验的条件，用鲜叶做试验送样麻烦，应用微波炉烘干后寄往开展分子试验的单位快捷方便。育种家在野外考察或在试验基地工作时发现有特异性状的个体时均能采用微波炉烘干的方法带回实验室做进一步研究。

这个方法可为其他植物叶片保存提供参考。其他的分子试验能否这么应用，有待进一步研究。