黄芩苷固体脂质纳米粒的制备及其在小鼠体内组织分布研究

周 晶，欧阳怡，徐 倩，吴鸿飞

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

黄芩苷是唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根茎中提取分离出的一种黄酮类化合物，具抗炎、抗病毒、调节免疫功能等药理作用[1]。黄芩苷对乙型病毒性肝炎病毒的3种抗原有明显抑制作用[2]，对慢性乙型病毒性肝炎并发症有治疗效果[3]。黄芩苷已被广泛用于治疗急慢性肝炎，疗效确切[4]。但由于黄芩苷水溶性差、生物利用度低，限制了其临床应用。

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是以体内生物相容性较好，可生物降解的天然或合成类脂作为载药材料，将药物吸附或包裹在脂质核中，形成粒径为10～1 000 nm的纳米颗粒[5]。黄芩苷制备成SLN，可提高黄芩苷的生物利用度[6]。

为扩展黄芩苷的临床应用，本实验选用单硬脂酸甘油酯、胆固醇混合脂质作为载药材料制备黄芩苷-SLN分散液，并将黄芩苷-SLN分散液制成黄芩苷-SLN冻干粉。通过小鼠体内组织分布实验，比较黄芩苷-SLN冻干粉混悬液和黄芩苷混悬液在小鼠体内的分布特性，为黄芩苷-SLN的临床应用提供参考。

1 材料

1.1 试药 黄芩苷(纯度为85.94%，批号 141201)：四川省玉鑫药业有限公司；黄芩苷对照品(纯度≥98%，批号 110715-201312)、芦丁对照品(纯度≥98%，批号 100080-201406)：中国食品药品检定研究院；单硬脂酸甘油酯(批号 Y05A8S41269)、胆固醇(批号 L29N8F49258)：上海源叶生物科技有限公司；聚乙二醇400(批号 30150828)：国药集团化学试剂有限公司；磷脂(批号 20150365)：合肥沃森生物科技有限公司；其余试剂为化学纯或分析纯。

1.2 仪器 UV-250紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；BXXW-LGJ-10真空冷冻干燥机：北京市博翔兴旺科技发展有限公司；Nicolet 380型傅里叶变换红外光谱：美国Nicolet公司；DSC204差示扫描量热仪：德国Netzsth公司；Zetasizer 3000HS型粒径测定仪：英国马尔文公司；JEM-2100F型透射电子显微镜：日本电子株式会社；Agilent 1260型高效液相色谱仪：美国安捷伦有限公司。

1.3 实验动物 昆明种普通级雄性小白鼠，体质量(20±2)g。实验动物均由安徽医科大学实验动物中心[生产许可证：SCXK(皖)2017-0001]提供。

2 方法

2.1 黄芩苷-SLN分散液的制备 乳化蒸发-低温固化法制备黄芩苷-SLN分散液[7]。精密称取黄芩苷5.0 mg、单硬脂酸甘油酯25.0 mg、胆固醇25.0 mg、磷脂50.0 mg，溶于10 mL无水乙醇中，于72 ℃恒温水浴中加热使其充分溶解，构成有机相。精密称取25.0 mg聚乙二醇400溶于30 mL双蒸水构成水相。将有机相在1 000 r/min搅拌下缓慢注入水相，温度维持在(72±2)℃，搅拌条件下蒸发除去有机溶剂并浓缩至(20±3)mL，得到黄色半透明乳液。将所得乳液置于冰水混合物中，1 000 r/min搅拌下冷冻固化2 h，得到黄芩苷-SLN分散液。不添加黄芩苷，按照上述制备方法得到空白SLN分散液。

2.2 黄芩苷-SLN分散液的评价 透射电子显微镜观察黄芩苷-SLN分散液中纳米粒的形态[8]，马尔文粒度仪考察黄芩苷-SLN分散液中纳米粒的粒径、多分散指数(polydispersity index，PDI)和Zeta电位。

2.3 体外释药考察

2.3.1 紫外分光光度法线性试验及其方法学考察 精密称取黄芩苷对照品10.8 mg，无水乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中作为储备液，分别精密吸取10、30、50、70、90、100 μL于10 mL容量瓶中，加透析介质稀释至刻度，得到质量浓度(ρ)分别为1.08、3.24、5.40、7.56、9.72、10.8 μg/mL系列对照品溶液，280 nm波长测定吸光度(A)值，计算得到回归方程。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3种浓度黄芩苷对照品溶液，1 d内测定5次，考察日内精密度；5 d中每日测定1次，考察日间精密度。精密吸取空白SLN分散液1 mL，加入黄芩苷及乙醇配制成3.24、5.40、10.8 μg/mL 3种浓度的对照品溶液，在280 nm处测定A值，将所得数据代入标准曲线方程计算，得到回收率。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3种浓度黄芩苷对照品溶液，分别于0、2、4、6、8 h测定，考察重复性。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3种浓度黄芩苷对照品溶液，室温避光放置24 h后测定，考察稳定性。

2.3.2 体外释药方法 采用透析袋法测定黄芩苷-SLN分散液在含0.2% Tween80的PBS溶液(pH=7.4)中的释放行为，释放容积为100 mL。取黄芩苷-SLN分散液10 mL(相当于黄芩苷A质量2.5 mg)置于透析袋内，转速为100 r/min，温度为(37.0±0.5)℃，在预定时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h取样5.0 mL，同时补充同容积释放介质。通过紫外分光光度仪测定样品中药物浓度，计算累计释放度。

2.4 黄芩苷-SLN冻干粉的制备 取20 mL黄芩苷-SLN分散液置于塑料表面皿中，加入0.6 g D-甘露糖，保鲜膜包封塑料表面皿，于-80 ℃预冻24 h。迅速转移至-50 ℃冻干机搁板上进行冻干，冷冻干燥24 h，得到黄芩苷-SLN冻干粉。

2.5 黄芩苷-SLN冻干粉的评价 按文献[8]的方法在透射电子显微镜下观察黄芩苷-SLN冻干粉中纳米粒的形态，考察其粒径、PDI和Zeta电位。按“2.1”项下方法制备空白SLN分散液，再按“2.4”项下方法制备空白-SLN冻干粉，按处方比例混合黄芩苷及空白-SLN冻干粉研磨后得到物理混合物。分别取适量黄芩苷、物理混合物、空白-SLN冻干粉和黄芩苷-SLN冻干粉，按照文献[8]的方法利用差式扫描量热仪、傅里叶红外光谱对上述样品进行扫描，分析药物在黄芩苷-SLN冻干粉中的存在状态。

2.6 黄芩苷体内测定方法的建立

2.6.1 溶液的配制 精密称取黄芩苷对照品5.08 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容得浓度为50.8 μg/mL的黄芩苷对照品储备液。精密称取芦丁5.43 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容得浓度为54.3 μg/mL芦丁母液。精密吸取芦丁母液3.40 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，甲醇定容得浓度为7.41 μg/mL的芦丁内标储备液。上述溶液均放于4 ℃冰箱保存备用。

2.6.2 色谱条件 色谱柱：Welch C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-体积分数为0.1%磷酸水溶液(容积比47∶53)；检测波长为280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：32 ℃；进样量：20 μL。

2.7 组织样品的处理 精密称量小鼠各器官组织，加3倍量的甲醇组织匀浆。精密量取1 mL组织匀浆液，于8 000 r/min下离心10 min，吸取上清液400 μL置于EP管中。分别加入7.41 μg/mL内标物芦丁200 μL，甲醇600 μL，乙腈800 μL及1 mol/L磷酸二氢钾水溶液200 μL。将样品涡旋超声后，于10 000 r/min下离心10 min，移取上清液置于另一个EP管中，50 ℃水浴氮气吹干，残留物采用100 μL流动相溶解，涡旋，于20 000 r/min下离心10 min，吸取上清液，按“2.6.2”项下色谱条件进样。

2.8 小鼠组织分布实验 健康昆明种小鼠108只，随机分为2组，每组54只。按照9.5 mg/mL黄芩苷质量浓度配置黄芩苷-SLN冻干粉混悬液(黄芩苷-SLN冻干粉用双蒸水复溶，临用时现场配制)和黄芩苷混悬液(将黄芩苷原料药分散在双蒸水中，临用时现场配制)。一组小鼠灌胃黄芩苷-SLN冻干粉混悬液(剂量为144 mg/kg)，另一组小鼠灌胃黄芩苷混悬液(剂量为144 mg/kg)，给药后分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h脱颈处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑，清洗组织表面血液，滤纸吸干，精密称量后放入EP管中备用，再按照“2.7”项下方法处理。

按照文献[9]的方法，以靶向效率(targeting efficiency，Te)、相对靶向效率(relative targeting efficiency，Rte)和靶向指数(targeting index，TI)为评价指标，考察黄芩苷-SLN冻干粉混悬液相对于黄芩苷混悬液的靶向性。采用DAS 2.0软件拟合得到相关药物代谢动力学参数，计算公式如下：

R(Te)=A(AUCi靶向)/∑A(AUCi)

R(TI)=A(AUCi靶向)/A(AUCi参比)

R(Rte)=[R(Te靶向)-R(Te参比)]/R(Te参比)

式中AUCi为浓度-时间曲线的第i个组织的药时曲线下面积(area under curve, AUC)，∑AUCi参比是包括靶组织在内的所有组织的AUC之和。AUCi参比为参比制剂的AUCi，Te参比为参比制剂的Te。

3 结果

3.1 黄芩苷-SLN分散液中纳米粒的外观形态、粒径及Zeta电位 黄芩苷-SLN分散液中纳米粒呈圆形或椭圆形，大小均一，见图1。粒径为(207±5.9)nm，分散系数为0.134±0.011，见图2A。Zeta电位为(-35.4±7.5)mV，见图2B。

图1 透射电子显微镜下黄芩苷-SLN分散液的形态(×20 000倍)

图2 黄芩苷-SLN分散液粒径分布图(A)和电位图(B)

3.2 黄芩苷-SLN分散液的释放度

3.2.1 方法学考察 黄芩苷在溶出介质中最大吸收波长为280 nm，标准曲线为A=0.081 7ρ-0.035 5(r=0.999 0)，线性范围是1.08～10.8 μg/mL。结果显示，日间、日内精密度RSD均小于2%，回收率为99.21%～99.76%，重复性和稳定性的RSD均小于2%，该方法可用来考察黄芩苷-SLN分散液的释放度。

3.2.2 黄芩苷-SLN分散液释放度方程的拟合 以累积释放度Q对时间t作图，得到累积释药曲线，见图3。通过零级动力学、一级动力学、Higuchi、Ritger-Peppas方程拟合，黄芩苷-SLN分散液中黄芩苷-SLN体外释放最符合Ritger-Peppas方程(r=0.955 6)。见表1。

图3 黄芩苷-SLN分散液体外释放曲线(n=3)

3.3 黄芩苷-SLN冻干粉中纳米粒的外观形态、粒径和Zeta电位 黄芩苷-SLN冻干粉中纳米粒呈圆形或椭圆形，见图4。黄芩苷-SLN冻干粉粒径为(398.5±2.08)nm，PDI为0.562±0.023，见图5A；Zeta电位为(-16.4±6.96)mV，见图5B。

表1 黄芩苷-SLN分散液体外释放曲线方程拟合

图4 透射电子显微镜下黄芩苷-SLN冻干粉的形态(×20 000倍)

3.3.1 采用差式扫描量热仪进行样品热分析 取适量黄芩苷、物理混合物、黄芩苷-SLN冻干粉及空白-SLN冻干粉，以空铝坩埚为参比物，在另一铝坩埚放入约5 mg的样品，升温速率为20 ℃/min，扫描范围为50～250 ℃，差式扫描量热仪分析结果见图6。黄芩苷在220 ℃出现单一吸收峰，此吸收峰为黄芩苷结晶吸热峰；空白-SLN冻干粉在140 ℃左右出现单一吸收峰，该吸收峰与冻干保护剂D-甘露糖的熔点峰相近，应为D-甘露糖的吸热峰；物理混合物中两者特征峰并未发生明显变化，表明药物晶型未发生改变，仍以结晶形式存在；黄芩苷-SLN冻干粉未见黄芩苷特征吸热峰，除D-甘露糖吸热峰外无其他显著吸热峰，表明黄芩苷存在形态变化，以无定形状态存在于黄芩苷-SLN冻干粉中。

图5 黄芩苷-SLN冻干粉粒径分布图(A)和电位图(B)

注：a.黄芩苷；b.物理混合物；c.空白-SLN冻干粉；d.黄芩苷-SLN冻干粉

图6 样品的差式扫描量热分析图谱

3.3.2 采用傅里叶红外光谱进行结构分析 取适量黄芩苷、物理混合物及黄芩苷-SLN冻干粉与KBr混合压片，于400～4000 cm-1的红外光下扫描，见图7。结果显示黄芩苷在3 300、1 000 cm-1处分别出现了羟基、羰基特征吸收峰，在1 600 cm-1处出现苯环骨架伸缩振动特征吸收峰(见图7a)。黄芩苷在物理混合物(3 300、1 600、1 000 cm-1，见图7b)和黄芩苷-SLN冻干粉(3 300、1 600、1 000cm-1，见图7c)中的特征吸收峰基本一致，未出现新特征吸收峰，表明在黄芩苷-SLN冻干粉制备过程中药物的化学性质未变化。

注：a.黄芩苷；b.物理混合物；c.空白-SLN冻干粉；d.黄芩苷-SLN冻干粉

图7 样品的傅里叶红外光谱分析图谱

3.4 方法学考察

3.4.1 专属性考察 以肝组织为例，黄芩苷和芦丁的保留时间分别为14.41 min和7.59 min，见图8。两者分离度良好，组织中内源性物质不干扰黄芩苷和芦丁的测定，该方法专属性良好。

注：A.肝组织匀浆液；B.加药肝组织匀浆液+芦丁内标；C.空白肝组织匀浆液；1.芦丁；2.黄芩苷

图8 小鼠肝组织样品专属性考察

3.4.2 线性回归方程和线性范围考察 精密移取空白组织匀浆液400 μL置于10 mL EP管中，加入黄芩苷对照品溶液，得到一系列不同质量浓度(0.068 58、0.114 3、0.190 5、0.317 5、0.630 0、1.270 0、2.540 0、5.080 0、10.160 0 μg/mL)的黄芩苷对照品溶液，按照“2.7”项下方法处理组织样品，按照“2.6.2”项下色谱条件测定血浆和组织样品中黄芩苷和芦丁的峰面积，以黄芩苷与芦丁的峰面积比值(R)对质量浓度(ρ)进行线性回归，得到各组织样品的回归方程。结果见表2。

3.4.3 精密度和回收率试验 取各空白组织匀浆液400 μL配制黄芩苷低浓度(0.068 58 μg/mL)、中浓度(2.54 μg/mL)、高浓度(10.16 μg/mL)组织样品，按照“2.7”项下方法处理组织样品后进样分析。日内精密度各浓度样品测定5次，日间精密度每天进样1次，连续5 d，计算绝对回收率及相对回收率。结果显示，3种浓度的日内精密度和日间精密度均小于8.7%，3种浓度的绝对回收率为85.45%～94.88%，相对回收率为98.28%～101.94%，满足测试方法学要求。

表2 黄芩苷在小鼠各组织样品中的回归方程

3.4.4 重复性和稳定性试验 取各空白组织匀浆液400 μL，配制黄芩苷低浓度(0.068 58 μg/mL)、中浓度(2.54 μg/mL)、高浓度(10.16 μg/mL)组织样品各1份，分别于0、2、4、6、8 h，按照“2.7”项下方法处理组织样品后进样分析。取各空白组织匀浆液400 μL，配制黄芩苷低浓度(0.068 58 μg/mL)、中浓度(2.54 μg/mL)、高浓度(10.16 μg/mL)组织样品各5份，分别于室温放置24 h，-20 ℃反复冻融2次，按照“2.7”项下方法处理组织样品后进样分析。结果显示，3种浓度的重复性RSD均小于9.1%，3种浓度的室温稳定性、冻融稳定性的RSD均小于9.4%，满足测试方法学要求。

3.5 小鼠体内组织分布研究 与黄芩苷混悬液组小鼠各组织AUC0-t相比，黄芩苷-SLN冻干粉混悬液组小鼠各组织的AUC0-t均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。结果表明口服黄芩苷-SLN冻干粉混悬液可能通过提高黄芩苷生物利用度[6]，提高药物在小鼠各组织器官中分布。

由Te的结果可见，黄芩苷-SLN冻干粉混悬剂组小鼠体内的分布趋势为：R(Te肝)>R(Te脾)>R(Te脑)>R(Te肾)>R(Te肺)>R(Te心)；黄芩苷混悬剂组小鼠体内分布趋势为：R(Te肝)>R(Te脑)>R(Te肾)>R(Te肺)>R(Te脾)>R(Te心)。结果表明，黄芩苷混悬液主要分布在小鼠体内肝、脑、肾组织中，而黄芩苷-SLN冻干粉混悬液主要分布在小鼠肝、脾、脑组织中。黄芩苷被包载于SLN后，药物在小鼠体内分布明显变化。

黄芩苷-SLN冻干粉混悬液组小鼠心、脾的Rte分别为40.47%、79.67%，均为正值，其余组织的Rte均为负值；黄芩苷-SLN冻干粉混悬液组小鼠各组织的TI均大于1，各组织的TI大小顺序为：R(TI脾)>R(TI心)>R(TI肝)>R(TI脑)>R(TI肾)>R(TI肺)，黄芩苷-SLN冻干粉提高了药物在小鼠体内各个脏器内的分布，对脾脏、心脏的靶向性较好。

表3 小鼠体内组织药物分布结果(n=6)

注：与黄芩苷混悬液比较，*P<0.05

4 讨论

本实验制备黄芩苷-SLN分散液，为提高SLN表面膜的稳定性[10]，降低药物和SLN的水解和氧化速度，加入冻干保护剂，利用冷冻干燥技术制备黄芩苷-SLN冻干粉。黄芩苷-SLN由于在冷冻干燥过程中，随着水分散失，粒径间出现聚集粘结导致粒径增大[11]。SLN分散液制备成SLN冻干粉，有助于SLN获得长期的物理和化学稳定性[12]，对保持实验中药物的一致性具有积极意义。

小鼠灌胃黄芩苷-SLN冻干粉混悬液后，肝组织靶向指数为41.19。黄芩苷-SLN冻干粉可提高药物吸收，较好地靶向分布于肝组织，更好地治疗肝脏疾病。此外，黄芩苷-SLN选择性地靶向分布小鼠脾组织，可能与实验利用胆固醇作为载脂材料有关。外源性摄入的胆固醇可在小肠腔内与磷脂、胆酸盐结合形成微粒，并与长链脂肪酸结合形成胆固醇酯[13-14]。胆固醇酯促进乳糜微粒的形成，乳糜微粒易由肠道淋巴系统摄取[15-16]，因此可提高药物在淋巴组织中的浓度。实验制备的黄芩苷-SLN在小鼠肝组织中分布量最大，对脾组织的靶向性较强，表现出良好的肝靶向及促进药物经淋巴转运的潜力，对其临床应用具有积极的意义。