人参皂苷Rg1对辐射致肠IEC-6细胞损伤保护作用的体外实验

王毓国，窦永起，赵 森

解放军总医院第一医学中心 中医科，北京 100853

放射性肠损伤是肿瘤放射治疗的常见并发症，有研究表明在腹部、盆腔放疗中，60%以上患者出现腹痛、恶心、腹胀、便血等放射性肠损伤的早期症状，而放射性肠损伤后期可能会出现肠梗阻，甚至肠穿孔[1-2]。因此，放射性肠损伤的发生降低了肿瘤治愈率。目前，该病的发生机制已基本明确：一方面，放射线的直接杀伤作用可引起快速增殖的肠上皮细胞死亡；另一方面，细胞内活性氧类增加，核DNA损伤，引发细胞凋亡。两方面均导致肠上皮更新速度减缓，肠道屏障破坏[3-4]。近年来，手术、氨磷汀注射、抗生素、高压氧等多种治疗方式虽然取得了一些效果，但存在作用范围小、不良反应多等缺陷[5]。而越来越多的临床研究表明，中医药能够有效减轻患者的消化道反应，提高生存质量，且本团队前期证实了益气凉血解毒中药能够有效减轻大鼠放射性肠损伤，抑制炎症反应[6-8]。人参皂苷Rg1是人参中的主要成分之一，研究证实其可有效改善辐射导致的皮肤损伤、神经损伤，但Rg1对肠细胞辐射损伤的治疗研究却鲜有报道[9-10]。因此，本实验拟探讨Rg1对辐射致IEC-6细胞损伤的保护作用，并探索其作用机制。

材料和方法

1 实验材料与仪器 细胞系：选择大鼠小肠隐窝上皮细胞(intestinal epithelial cell No.6，IEC-6)，购自国家实验细胞资源共享平台。实验用试剂：人参皂苷Rg1(货号：E035580)、LY294002(货号：F035850)均购自上海一飞生物科技有限公司；胎牛血清(货号：FSP500)、PBS(货号：C10010500bt)购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；胰酶(货号：25200-072)购自赛默飞世尔科技有限公司公司；DMEM培养液(货号：26418007)购自康宁公司；CCK-8试剂(货号：CK04)购自东仁化学科技有限公司；裂解液(货号：Cat.#1610747)购自伯乐公司；凋亡试剂盒(货号：E-CK-A211)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；p-AKT抗体(货号：BSM-52131R)购自北京博奥森生物技术有限公司；Bax抗体(货号：ab32503)购自艾博抗公司；Bcl-2抗体(货号：ab59348)购自艾博抗公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒(货号：G2003)购自武汉赛维尔生物科技有限公司。仪器：60Co-γ照射装置(军事医学科学院军事医学研究院)；CO2培养箱：赛默飞HEPA dass100；洁净工作台：中国冠鹏900；高速离心机：长沙TDZ5-WS；酶标仪：赛默飞2030-0050；流式细胞仪：碧迪Calibur。

2 细胞培养及处理 大鼠IEC-6细胞于含有5% FBS和0.01 mg/ml胰岛素的DMEM培养液中培养，培养箱条件为37℃、5% CO2、饱和湿度，汇合度达80%时传代培养。参考文献[11]方法进行照射，照射源由军事医学研究院提供，照射剂量为4 Gy，距离4 m。实验分为空白组(Control)、模型组(Model)、中药组(Rg1)及中药+抑制剂组(Rg1+LY294002)。

3 CCK8法测定细胞活力 消化生长状态良好的IEC-6细胞，进行计数后，以2×103/ml的细胞密度接种于96孔板上(200μl/孔)，中药组加入10μmol/L的人参皂苷Rg1，中药+抑制剂组加入同等浓度Rg1外，再滴加10μmol/L的LY294002。随后置于37℃、5% CO2培养箱中培养。分别于照射后12 h、24 h、36 h，每孔加入100μl含10% CCK-8的培养基孵育1 h，使用酶标分析仪测量各孔光密度值。

4 Annexin V-FITC/PI双染法检定IEC-6细胞的生存率及凋亡率 将细胞以4×105/孔接种于六孔板，各组药物干预处理同CCK-8，依照Annexin V-PI凋亡检测试剂盒说明，对照射后12 h、24 h、36 h细胞凋亡率进行检测。先用0.25%胰酶消化细胞，转移至离心管进行离心(1 000 r/min，5 min)。弃上清，用PBS重悬细胞，再次离心1次，弃上清，用100μl Binding Buffer重悬细胞，加入5μl的Annexin-V和5μl的PI混匀后，避光反应20 min，使用流式细胞仪检测生存率和凋亡率。

5 Western blot法测定细胞p-AKT、Bcl-2、Bax表达 收集细胞，提取细胞蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳、转至PVDF膜、常温封闭、孵育、一抗4℃过夜、二抗室温结合、漂洗等操作后，采用图像分析软件Adobe PhotoShop分析结果，检测各组p-AKT、Bcl-2、Bax相对表达水平。

6 统计学分析 所有数据采用SPSS19.0软件进行统计学处理。数据均以-x±s表示，符合正态分布且方差齐的细胞活性及Bcl-2、Bax蛋白表达实验结果的组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，其余数据方差不齐，两两比较采用Tamhane检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 人参皂苷Rg1对辐射后IEC-6细胞增殖活力的影响 CCK-8结果表明，照射后12 h、24 h、36 h各照射组细胞增殖活力较空白组均出现下降趋势，其中12 h时模型组(0.47±0.01)及中药+抑制剂组(0.47±0.02)细胞增殖活力明显低于空白组(0.51±0.02，P＜0.05)，且中药组(0.51±0.01)高于模型组及中药+抑制剂组(P＜0.05)；24 h时中药组(0.52±0.01)仍高于模型组(0.47±0.01，P＜0.05)及中药+抑制剂组(0.47±0.01，P＜0.05)。见图1。

图 1 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6细胞活力比较(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.1 Comparison of activity of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

图 2 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6细胞生存和凋亡的流式细胞图(n=9)Fig.2 Flow cytometry of survival and apoptosis of IEC-6 cells in each group at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9)

2 人参皂苷Rg1对辐射后IEC-6细胞存活率和凋亡率的影响 照射后12 h：与空白组比较，模型组及中药+抑制剂组IEC-6细胞存活率明显降低(P＜0.05)，凋亡率显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，中药组细胞存活率升高(5.53%±4.14% vs 78.89%±6.89%，P＜0.05)，凋亡率降低(73.39%±16.46% vs 12.14%±3.02%，P＜0.05)；且中药组存活率高于中药+抑制剂组(78.89%±6.89% vs 5.67%±3.91%，P＜0.05)，凋亡率低于中药+抑制剂组(12.14%±3.02% vs 90.26%±5.41%，P＜0.05)。照射后24 h：模型组及中药+抑制剂组存活率低于空白组(P＜0.05)，中药组存活率高于中药+抑制剂组(P＜0.05)；中药+抑制剂组凋亡率高于空白组和模型组(P＜0.05)，中药组凋亡率低于中药+抑制剂组(P＜0.05)。照射后36 h：模型组、中药组细胞存活率较空白组相当(P＞0.05)，而中药+抑制剂组仍低于空白组(P＜0.05)，凋亡率均高于其他组(P＜0.05)，见图2 ～ 图4。

图 3 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6细胞存活率变化(n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.3 Changes of survival rate of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

图 4 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6细胞凋亡率变化(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.4 Changes of apoptotic rate of IEC-6 cells in each group after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

图 5 各组IEC-6细胞p-AKT、Bcl-2及Bax表达情况(n=9) A:p-AKT表达； B:Bcl-2表达； C:Bax表达； D:Bax/Bcl-2比值(aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.5 Expression of p-AKT,Bax and Bcl-2 in IEC-6 cells of each group (n=9) A:p-AKT expression;B:Bcl-2 expression;C:Bax expression;D:Bax/Bcl-2 ratio (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

3 人参皂苷Rg1对辐射12 h时IEC-6细胞p-AKT、Bcl-2和Bax表达的影响 统计分析结果表明：各组p-AKT相对表达量比较，模型组及中药+抑制剂组较空白组明显下降(P＜0.05)，与模型组比较，中药组升高(0.49±0.07 vs 0.66±0.07，P＜0.05)，中药+抑制剂组降低(P＜0.05)；各组Bax和Bax/Bcl-2相对表达量比较，模型组、中药+抑制剂组Bax和Bax/Bcl-2均高于空白组(P＜0.05)，中药组Bax低于模型组(0.11±0.03 vs 0.28±0.04，P＜0.05)，中药组Bax/Bcl-2低于模型组(0.39±0.11 vs 2.54±0.71，P＜0.05)，中药组Bax和Bax/Bcl-2均低于中药+抑制剂组(P＜0.05)；Bcl-2相对表达量比较，各照射组均低于空白组(P＜0.05)，中药组较模型组升高(0.30±0.03 vs 0.12±0.04，P＜0.05)，且高于中药+抑制剂组(P＜0.05)。见图5。

讨 论

放射性肠损伤是放疗的主要并发症，给患者带来较大痛苦，一直缺乏有效的治疗手段及药物。IEC-6细胞是取自健康大鼠空肠隐窝部位，并在体外培养成的细胞系，能较好地体现肠上皮细胞的生物特性，是放射性肠损伤研究中的经典细胞类型[12]。有研究表明，人参单体及多种有效成分均具有辐射防治作用，如人参可通过阻断ROS的产生，抑制Caspase、p38等通路来保护细胞[13]；人参皂苷Rg1能够增强小鼠造血干/祖细胞对辐射衰老的抵抗力[14]，还能够通过Nrf2/HDAC2信号减弱射线诱导的糖皮质激素抵抗[15]；人参多糖可调节Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达，对小鼠肠辐射损伤产生保护作用[16]。但Rg1对辐射所致肠IEC-6损伤的治疗研究极少。有动物实验表明，Rg1是人参中抑制肠隐窝细胞凋亡的最有效成分之一。本团队研究表明，益气凉血中药能够有效延缓病情发展，延长大鼠生存期。因此，本实验拟证实Rg1对辐射致肠IEC-6细胞凋亡的抑制作用。

PI3K/AKT是一条经典的促生存和抗凋亡通路，其中PI3K具有蛋白激酶活性，可产生胞内信使PIP3，调节细胞凋亡、增殖、代谢[17-18]。PIP3可以与AKT结合，产生磷酸化的p-AKT，激活下游靶点Bcl-2。Bcl-2蛋白可直接调节线粒体膜的通透性，调节凋亡因子的释放，而Bax的高表达可促进细胞凋亡，Bcl-2与Bax是一对凋亡相关蛋白，Bcl-2可以和Bax形成二聚体，进而促进细胞生存、抑制凋亡[19]。LY294002是PI3K的典型抑制剂，可靶向地抑制PI3K催化亚基p110的作用，进而抑制p-AKT的表达及下游因子的活化[20]。

本实验研究表明，IEC-6细胞在遭受辐射后，细胞活力下降，照射后12 h，模型组细胞存活率下降明显，中药组存活率明显高于模型组，表明人参皂苷Rg1能够有效促进照射后的IEC-6细胞恢复及生长，而同时应用IP3K抑制剂LY294002后，存活率显著下降。生存率及凋亡率比较显示，照射后细胞出现存活率下降、凋亡率升高的趋势，以模型组和中药+抑制剂组最明显，而人参皂苷Rg1能够有效促进细胞生存、减少凋亡发生，至照射后36 h，各照射组细胞状态逐渐恢复。课题组进一步选择细胞存亡组间差异最为显著的12 h行蛋白印迹检测，其结果提示人参皂苷Rg1有效促进p-AKT、Bcl-2的表达，抑制Bax表达。结合中药+抑制剂组蛋白表达情况，我们认为人参皂苷Rg1是通过促进PI3K/AKT的表达，进而达到抑制IEC-6细胞凋亡，促进存活，并保持其良好的增殖活性。

本实验阐释了人参皂苷Rg1对于放射线所致肠IEC-6细胞损伤的作用机制，为本病的临床治疗提供新的思路，为研制放射性肠损伤特效药奠定实验基础。