脑膜败血伊丽莎白菌耐药性及同源性分析

刘 喆，王丽凤，叶丽艳，沈定霞

解放军总医院第一医学中心 医学检验中心，北京 100853

脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica，EME)旧称脑膜脓毒金黄杆菌，2005年Kim等[1]将其从金黄杆菌中分列出来，以首次发现者Elizabeth的名字命名为脑膜败血伊丽莎白菌，归至伊丽莎白菌属。该菌广泛存在于医院的各种环境中。近年来，EME导致感染的病例有所增加。EME可以引起新生儿脑膜炎，在免疫力低下人群中可引起败血症、肺炎、心内膜炎等[2-3]。随着广谱抗菌药物的广泛使用，EME的耐药菌株也在增多，且呈现较为广泛的耐药性。为帮助临床合理选择抗菌药物，治疗EME引起的感染，本研究对我中心分离的44株EME进行常用抗菌药物的耐药性和菌株之间同源性的分析，菌株之间相似性大多＜90%，差异较大，无明确相关性。

材料与方法

1 菌株来源 选取2012年4月- 2018年12月我中心临床标本，按照同一患者相同来源菌株只计入第1次分离到的菌株的原则，获得44株EME供本研究使用。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肠球菌ATCC29212。

2 仪器和试剂 35℃恒温培养箱(Thermo公司)；VITEK MS(法国梅里埃公司)；血琼脂平板、中国蓝平板、M-H平板琼脂平板为英国Oxoid公司产品；96孔药敏板购自上海星佰生物技术有限公司，选取的抗菌药物有哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、米诺环素(MH)、环丙沙星(CIP)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(SXT)、万古霉素(VA)、利奈唑胺(LZD)。

3 细菌的复苏与鉴定 将临床保存好的EME菌种在血平板上传代1次，再用M-H琼脂平板传代2次，用质谱仪鉴定后备用[4-5]。

4 药物敏感性实验 采用微量肉汤稀释法检测12种抗菌药物对44株EME的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)[6]，实验中严格按照美国临床实验标准化协会(CLSI)的规则进行操作。菌液配制挑取菌落数个，置入2 ～ 3 ml灭菌0.9%氯化钠注射液中，用0.5麦氏比浊管进行比浊，调制菌液浓度为1.5×108CFU/ml左右。取上述菌液60μl，滴入无菌加样槽中，加营养肉汤液1支(12 ml)，混匀。用8通微量移液器，吸取稀释菌液100μl，加入除阴性对照孔以外的微量药敏板孔中，每孔中菌液含量为7.5×104CFU，阴性对照孔加100μl无菌营养肉汤液。将板条放入35℃培养箱培养24 h。自培养箱中取出板条，用干毛巾轻轻擦拭板条底部。肉眼判读各个孔的结果，粉色结果显示该孔有细菌生长，蓝色为无细菌生长，记录各种抗菌药物抑制该菌生长的最低药物浓度。除万古霉素和利奈唑胺外，其余10种抗菌药物按照CLSI关于非发酵菌抑菌圈标准进行敏感性的判读。

5 同源性检测 利用基质辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪(MS)检测44株EME的蛋白峰谱，并据此进行蛋白峰谱的差异比较。首先，用1μl定量接种环先将标准菌株大肠埃希菌ATCC8739均匀涂抹在质控位点的靶板上，然后加1μl的VITEK MS-CHCA基质液，待检的纯培养细菌涂板方法与质控菌株一致，等待靶板自然干燥后放入MS质谱仪器进行检测，然后仪器会自动将所得菌的蛋白质峰图与数据库中峰图进行比较，分析得出鉴定结果。

6 同源性分析方法 质谱仪通过自带软件Saramis获得细菌的蛋白质峰图信息，并将蛋白质峰图信息导入软件，进行各个峰图的成份分析及聚类分析，从而对细菌进行分型，分析菌株之间的同源性。菌株相似性＜90%为无同源性。

结 果

1 标本来源分布 标本采集自患者下呼吸道36例(81.7%)、血液2例(4.5%)、尿液1例(2.3%)和拭子1例(2.3%)，其次来自穿刺液、腹水、脓液、胆汁各1例(分别占2.3%)，共获得44株EME。其中男性患者34例，女性患者10例，多数患者伴有基础疾病，如高血压、糖尿病、肾病、车祸伤、脑外伤、慢阻肺、恶性肿瘤等。EME在我中心分布范围较广，多个病区均分离出该菌，其中最多的为各科室的ICU病房(43.2%)，其次为呼吸科和急诊科，分别占18.1%和13.6%。44株EME的科室分布见表1。

表1 脑膜败血伊丽莎白菌检出的科室分布Tab.1 Distribution of detection of Elizabethkingia meningoseptica bacteria in meningeal septicemia

2 药敏试验结果 万古霉素和利奈唑胺对金黄色葡萄球菌ATCC29213和肠球菌ATCC29212的MIC值在质控范围内，除万古霉素和利奈唑胺外其余10种抗菌药物对大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853的MIC值也在质控范围内。临床菌株药敏试验结果：EME对头孢菌素类、氨基糖苷类、碳青霉烯类和磺胺类抗菌药物均有很高的耐药性，呈现出多重耐药，除了亚胺培南外其余药物耐药率均高于80%，而对头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素的耐药率达到100%。对含酶抑制剂类抗菌药物哌拉西林/他唑巴坦的耐药率达到63.6%。该菌对米诺环素的耐药率为0，敏感率达到100%。个别菌株对复方新诺明敏感，大部分菌株对复方新诺明中度耐药，几乎所有菌株对碳青霉烯类(亚胺培南，美罗培南)、酶抑制剂类(哌拉西林/他唑巴坦)、头孢类、氨基糖苷类(庆大霉素，阿米卡星)、喹诺酮类(环丙沙星)高度耐药。见表2(中介指的是处于敏感和耐药之间)。

3 万古霉素和利奈唑胺的药敏实验结果 万古霉素和利奈唑胺对EME的MIC值均≥8μg/ml，其中万古霉素的MIC值集中在8 ～ 64μg/ml，≥128μg/ml各有1株菌，而利奈唑胺对EME菌的MIC值≥16μg/ml超过97%以上。见表3。

4 同源性分析 44株EME质谱同源性结果显示各菌株相似的百分比多数＜90%，菌株的采集时间和各科室分布均较分散，提示菌株之间无明确相关性。见图1。

图 1 44株EME质谱同源性分析Fig.1 Homology analysis by mass spectrometer of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica

表2 10种抗菌药物对44株EME细菌药敏试验结果Tab.2 Drug sensitivity test results of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica to 12 kinds of drugs (n,%)

表3 万古霉素和利奈唑胺对EME不同MIC值的菌株数Tab.3 Different minimum inhibitory concentration of Elizabethkingia meningoseptica to vancomycin and linezolid

讨 论

脑膜败血伊丽莎白菌是一种非发酵的革兰阴性杆菌，广泛存在于水和土壤环境中。该菌无芽孢、无鞭毛、无动力，在血平板、中国蓝平板和MH平板上均可生长，其中在血平板上37℃培养24 h后，会形成白色或黄色菌落，呈圆形且边缘整齐[7]。该菌在医院很多处存在，如水槽、水龙头、吸痰器、鼻导管、氧气瓶等。近年来，关于该菌引起的新生儿和早产儿感染、免疫力低下成年人医院获得性肺炎的报道屡见不鲜。目前，该菌已被认为是医院感染常见的条件致病菌之一。本研究结果显示，44株EME主要来自下呼吸道标本(占81.7%)，其余血、尿等一些无菌体液标本均较少(占18.3%)，与宁兴旺等[8]报道的EME主要引起病人下呼吸道感染基本一致。另外，44株EME感染患者主要来自肾病科、神经科等6个科室的ICU病房，其次来自呼吸科和急诊科，分别占43.2%、18.1%和13.6%。分析原因，与ICU病房患者大多合并基础疾病，健康营养条件差，呼吸科患者大量使用呼吸机、吸痰器以及急诊科患者多有脑外伤、车祸伤、手术创伤等有关[9]。且这些患者多数接受各种侵入性检查，如静脉插管、机械通气等，EME通过伤口进入机体从而引起感染[10]。加强医院环境定期消毒，加强介入性医疗操作无菌规范是有效预防EME引起医院感染的重要途径。

EME具有多重耐药性，尤其对用于治疗革兰阴性杆菌感染的抗菌药物，如头孢类、氨基糖苷类以及碳青霉烯类[8,11-15]。本研究药敏结果显示44株EME对阿米卡星、环丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和美罗培南耐药率均高于80%，对头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素的耐药率高达100%。这与宁兴旺等[8]报道结果一致。因此，临床治疗时避免使用此类抗菌药物。而对含酶抑制剂类抗菌药物哌拉西林/他唑巴坦的耐药性也达到了63.6%，这与殷丽军等[11]报道的差异较大。可能是由于我中心感染患者来自ICU病房较多，已经广泛使用抗菌药物进行治疗，导致菌株多重耐药有关。另外，EME对米诺环素有较好的抗菌活性，敏感率达到100%，因此，米诺环素可作为经验治疗EME感染首选药物。

多项报道提示万古霉素和利奈唑胺对EME有较好的抗菌活性[16-18]。但本次研究药敏试验结果显示两者MIC值均较高，由于CLSI并没有关于万古霉素和利奈唑胺对EME的折点范围，因此建议谨慎选用这两种药物治疗EME所致的感染。

于涛等[18]曾报到利用PFGE对EME进行分型，发现ICU治疗室台面和该科护士的手有相同的PFGE图谱，表明受污染的物体表面与医护人员的手会造成EME传播。对菌株进行同源性分析有许多方法，如PFGE、测序等。这两种方法分辨率较高，可以更精准地对菌株进行同源性分析。本文中采用质谱仪对菌株进行同源性分析虽然相对粗糙，但该方法简单、快速，而且质谱仪是临床实验室常用设备，且该仪器本身的数据库支持同源性分析，因此该方法可作为临床初步判定菌株间传播流行的依据。本研究利用质谱仪对44株EME进行初步同源性分析，结果显示从采集时间和科室分布来看，各菌株相似程度较低，即各株EME之间无明确相关性，说明EME在我中心各科室间没有引起传播流行。