宫腔内灌注粒细胞集落刺激因子联合低分子肝素在薄型子宫内膜患者冻融胚胎移植周期中的研究

白春梅，土增荣，王丽媛，段瑞云

在辅助生殖技术（ART）中，薄型子宫内膜对临床医师及不孕患者来说都是相当棘手的问题。通常认为，子宫内膜厚度与体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期的妊娠率成正比[1]。当子宫内膜厚度≤7 mm时，即可称为薄型子宫内膜，此时妊娠率会明显降低[2]，常导致反复种植失败（RIF）的发生。对于此类患者的治疗，国内外许多学者进行了大量探索性的研究。有研究表明粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可明显增加子宫内膜厚度，改善子宫内膜容受性，提高临床妊娠率[3-4]，但仍存在争议。为了提高胚胎植入率、降低流产率，低分子肝素（LMWH）被作为一种新的策略应用于ART中，其具有更高的生物利用度和半衰期，有抗凝血及抗凝血酶作用，在一定程度上被认为可改善ART妊娠结局[5-6]。本研究拟对175例冻融胚胎移植（FET）周期中的薄型子宫内膜患者进行相关分析，从而探索G-CSF及LMWH的临床疗效及应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2019年10月于山西医科大学第一医院生殖中心进行FET助孕治疗的薄型子宫内膜患者175例。向患者交代可选治疗方案，并根据其意愿分为3组，A组：63例患者仅接受激素替代治疗作为对照组；B组：52例患者接受激素替代治疗+宫腔内G-CSF灌注；C组：60例患者接受激素替代治疗+宫腔内G-CSF灌注+皮下注射LMWH。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①本周期拟行FET助孕治疗；②既往新鲜胚胎移植周期或FET自然周期中子宫内膜厚度持续≤7 mm，且移植后未妊娠的患者；③年龄≤40岁；④有1个或1个以上优质冷冻胚胎；⑤血细胞分析及凝血功能未见异常。排除标准：①子宫内膜息肉、黏膜下子宫肌瘤、宫腔粘连等宫腔内占位性病变；②子宫畸形、输卵管积水等；③合并其他内外科疾病及精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 A组 从月经周期第3日起给予口服戊酸雌二醇片（补佳乐，1 mg/片，拜耳医药保健有限公司）2 mg/次，2次/d，连续5 d，之后调整剂量为3 mg/次，2次/d，每间隔2 d定期行阴道B型超声（B超）监测子宫内膜厚度及血流情况，对于子宫内膜厚度持续＜7 mm者根据患者意愿决定是否取消此次周期。当监测到子宫内膜厚度达最佳状态，血流丰富，阻力较小，且可观察到三线征时，给予肌内注射黄体酮注射液（20 mg/支，浙江仙琚制药股份有限公司）40 mg转化内膜，补佳乐持续口服至移植后14 d，若血人绒毛膜促性腺激素（hCG）阴性则停药，若血hCG阳性，持续用药至B超可探及宫内妊娠囊、胎芽及胎心搏动后减药。

1.3.2 B组 补佳乐及黄体酮注射液使用方法同A组，G-CSF使用方法如下。在患者签署知情同意书后，于月经周期第8日、第10日及第12日给予宫腔内灌注G-CSF（瑞白，150 μg/0.9 mL，齐鲁制药有限公司），并于每次灌注前行阴道B超测量子宫内膜厚度。对于第14日子宫内膜厚度仍未达到7 mm的患者继续于当天及第16日灌注，对于第16日子宫内膜厚度仍未达到7 mm的患者依患者自身意愿选择是否接受此次移植，不接受的患者取消周期。灌注方法如下：嘱患者排空膀胱，取膀胱截石位，常规消毒外阴、阴道，用1 mL注射器连接一次性人工授精管，抽吸0.9 mL G-CSF经宫颈管进入宫腔，抵达宫腔底部后轻微退回并注入药液，术毕平卧20 min。

1.3.3 C组 补佳乐、瑞白及黄体酮注射液使用方法同B组，本组患者使用LMWH皮下注射，使用前患者签署知情同意书，移植后当天即给予皮下注射低分子肝素钙（万脉舒，0.4 mL：4 100AXaIU，河北常山生化药业股份有限公司）4 100 U/次，1次/d，至移植后第14日，若血hCG阴性则停药，若血hCG阳性，持续使用至B超可探及宫内妊娠囊、胎芽及胎心搏动。用药期间需定期监测患者凝血功能及血小板计数情况，停药后复查肝肾功能。

1.4 观察指标 于月经周期第8日（D8）及内膜转化日使用阴道B超（SAMSUNG MEDISON VOLUSON E8彩色多普勒超声诊断仪）测量子宫内膜厚度及子宫内膜血流情况。①子宫内膜厚度：经阴道B超下选取内膜最厚处测量。②子宫内膜血流类型的测定[7]：Ⅰ型，不能监测到子宫内膜血流；Ⅱ型，仅可监测到子宫内膜下血流；Ⅲ型，可监测到子宫内膜及子宫内膜下血流。③血流指数测定：经阴道彩色多普勒超声测量子宫内膜搏动指数（PI）及阻力指数（RI）。PI=（收缩期最高血流速度－舒张期末血流速度）/平均速度，RI=（收缩期最高血流速度－舒张期末血流速度）/收缩期最高血流速度。④治疗结局：周期取消率＝取消周期数/所有周期数×100%，胚胎种植率＝着床胚胎数/正常胚胎移植数×100%，临床妊娠率＝妊娠周期数/所有移植周期数×100%，早期流产率＝流产周期数/所有临床妊娠周期数×100%，异位妊娠率＝异位妊娠周期数/所有临床妊娠周期数×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。满足正态分布的定量资料用均数±标准差（x±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，不满足正态分布的定量资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，3组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Bonferroni校正法，组内治疗前后比较采用Wilcoxon符号秩和检验；定性资料用例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以α＝0.05为检验标准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者一般情况比较 3组患者的年龄、不孕时间、体质量指数（BMI）、不孕类型及移植D3卵裂胚胎数比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 3组患者治疗前后子宫内膜厚度及子宫内膜增加幅度的比较 3组患者治疗后子宫内膜厚度均有增厚，差异有统计学意义（P＜0.05）。3组患者D8子宫内膜厚度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3组患者内膜转化日的子宫内膜厚度及子宫内膜增加幅度比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；B、C组患者内膜转化日的子宫内膜厚度及子宫内膜增加幅度均高于A组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），而B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 3组患者治疗前后子宫内膜血流类型及血流指数的比较 3组患者D8 Ⅱ+Ⅲ型血流比例、PI、RI比较差异无统计学意义（P＞0.05）；B、C组患者治疗后D8和内膜转化日比较Ⅱ+Ⅲ型血流比例明显增加，PI、RI降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。3组患者内膜转化日Ⅱ+Ⅲ型血流比例、PI、RI比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与A组相比，B、C组Ⅱ+Ⅲ型血流比例高，PI、RI低，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 3组患者治疗结局比较 3组患者在周期取消率、临床妊娠率、早期流产率、胚胎种植率方面差异均有统计学意义（P＜0.05），异位妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组相比，B、C组周期取消率降低，临床妊娠率及胚胎种植率增加，差异有统计学意义（P＜0.05），B、C组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与B组相比，C组早期流产率降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

3 讨论

适宜的子宫内膜对于妊娠起着关键作用。近年随着人工流产等一系列宫腔内操作的增加，薄型子宫内膜的发病率也呈升高趋势。大部分研究认为在ART新鲜周期hCG日或FET周期内膜转化日子宫内膜厚度≤7 mm，即可诊断为薄型子宫内膜[2]。

虽然临床上对于薄型子宫内膜的治疗有多种方法，例如大剂量雌激素[8]、西地那非[9]、生长激素[10]、低剂量阿司匹林肠溶片[11]等，但仍有部分不孕患者存在持续低反应性薄型子宫内膜。2011年Gleicher等[3]首次对4例薄型子宫内膜患者采用G-CSF宫腔灌注，结果显示子宫内膜厚度增加，4例患者均成功妊娠，其中1例异位妊娠。2013年Gleicher等[4]再次对21例患者进行研究，其中48 h内子宫内膜未增厚的患者给予二次灌注，结果表明灌注后子宫内膜厚度增加，临床妊娠率相应提高。自此大量相关研究均表明宫腔内灌注G-CSF可明显增加子宫内膜厚度，并增加子宫内膜血流灌注，降低血流阻力，从而提高临床妊娠率及活产率[12-13]。但也有部分研究认为G-CSF宫腔灌注并不能改善子宫内膜厚度，对临床妊娠率也无改善[14]。而LMWH被广泛用于ART中以降低血栓前状态复发性流产患者的早期流产率[5-6]，安全、有效。近年LMWH也可用于不明原因的复发性流产、RIF等，但疗效及使用剂量尚无统一标准，而薄型子宫内膜患者的RIF发病率偏高。在本研究中，G-CSF宫腔灌注可明显提高薄型子宫内膜患者的内膜厚度，增加子宫内膜血流灌注，降低因子宫内膜薄而致的周期取消率，从而提高胚胎种植率和临床妊娠率。在G-CSF灌注的基础上于ET后皮下注射LMWH可在一定程度上调节此类患者的凝血功能，从而降低早期流产率，二者结合使用可显著改善薄型子宫内膜患者的妊娠结局。

表1 3组一般情况比较

表2 3组间子宫内膜厚度的比较 [M（P25，P75）]

表3 3组间治疗前后子宫内膜血流情况的比较

表4 3组患者治疗结局的比较 [%（n/n）]

G-CSF是集落刺激因子家族中的一员，可刺激中性粒细胞增殖、分化、活化，在人类生殖进程中发挥重要作用，对整个月经周期的子宫内膜均具有一定的生理作用。G-CSF主要存在于正常卵泡及卵巢表面的颗粒细胞内，随月经周期的进展呈逐渐增加的趋势，在排卵前达到高峰，可结合其特定的受体从而发挥相应的作用，使子宫内膜增厚[15]；也可诱导单核细胞转化为巨噬细胞，发挥一定的吞噬作用，治疗子宫内膜炎症，从而促进子宫内膜修复并使之增厚[16]；同时能够促进子宫内膜下基底动脉生长，使内膜营养充分从而增厚[17]；也有研究表明，在胚胎着床过程中G-CSF能使子宫内膜间质细胞蜕膜化，在胚胎植入时起到一定的促进作用[18]。

LMWH是由普通肝素经酶化学反应解聚而来，分子质量较小，可与抗凝血酶结合，发挥抗凝及抗炎作用，抑制补体激活，参与子宫内膜循环的调节，促进内膜修复、增加其血流灌注及蜕膜化过程，进而有助于胚胎着床[19]。此外LMWH可促进子宫内膜基质细胞中的胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）及泌乳素（PRL）的表达，抑制胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）的产生，对胚胎着床窗口期内的子宫内膜发育和容受性起非常重要的作用[20]。另有研究证实，LMWH可调节在胚胎着床时高度表达的表皮生长因子（EGF），并与其结合，提高胚胎滋养层细胞的增殖及抗侵扰能力，减少滋养层细胞的凋亡，促进胚胎植入，从而降低早期流产率[21]。

综上所述，在FET周期中宫腔内灌注G-CSF对于增加子宫内膜厚度有积极意义，并有一定的潜力改善胚胎种植率及临床妊娠率，于移植后皮下注射LMWH对降低早期流产率有重要价值。但由于本次研究样本量偏少，存在不可避免的临床误差及偏倚，且目前的报道尚未对G-CSF的给药剂量及给药时间做出明确的界定范围及标准，所以尚需进一步的研究证实。