黄海透光层悬浮半导体矿物组成及其促进微生物胞外电子传递过程初探

刘 佳，孙 元，任桂平，鲁安怀，李 艳，丁●瑞

(造山带与地壳演化教育部重点实验室，矿物环境功能北京市重点实验室，北京大学 地球与空间科学学院，北京 100871)

2019年鲁安怀教授等首次提出“矿物膜”这一概念，揭示了地表广泛分布的天然铁锰氧化物等半导体矿物转化太阳能的重要过程。直接暴露于太阳光下的岩石表面广泛发育厚度约几十纳米到数百微米的铁锰氧化物“矿物膜”，在日光作用下，“矿物膜”表现出良好的光催化性能，可参与并发生一系列氧化还原反应(Luetal., 2019； 鲁安怀等，2019)。这一发现引起学科领域对地表广泛分布的半导体矿物光催化作用的极大关注。同时，在自然界中存在可利用矿物光电子能量的非光合微生物，非光合微生物可利用半导体光电子实现对太阳光能的间接利用，为矿物半导体介导非光合微生物间接利用太阳光能提供了新途径(Luetal., 2012； 鲁安怀等，2013，2014)。

半导体矿物-微生物群落之间可发生电子传递过程(Renetal., 2018； Luetal., 2019)，陆地地表铁锰氧化物“矿物膜”半导体特性与日光催化效应，可直接影响该生境中微生物群落构成、胞外电子传递效率及代谢活性(Renetal., 2019)。天然铁锰氧化物能与氧气共同作为微生物新陈代谢活动的终端电子受体，参与并有效促进微生物胞外电子传递(Renetal., 2017； 任桂平等，2017)。除了陆地之外，受太阳光影响的地球表面还有海洋透光层，较之地表土壤、戈壁等生境，水圈中微生物的种类及含量更为富集。

水圈是地球外圈层中作用最为活跃且连续不规则的圈层，包括海洋、湖沼、河流、冰川、地下水以及大气层中的水分等(黄力等，2017)。水圈中存在地球上一半以上的微生物，包括细菌、真菌、藻类、病毒等，水圈微生物对地球元素循环(如碳、氮、硫元素)起到关键驱动作用(Bremner and Steele, 1978； Grossartetal., 2011； Prokopenkoetal., 2013)。海洋透光层一般认为是自然光穿过海水时达到光能衰减至1%的水层，其范围为从顶部海水表面到底部光合辐射降至表面1%处(Kirk，1994)。海水透光层中存在大量悬浮颗粒物，如在西北太平洋中发现悬浮颗粒物主要由矿物颗粒、生物碎屑颗粒和胶态絮凝体组成，其中矿物颗粒主要为含氧盐类矿物、氧化物和氢氧化物以及硫化物(胡文烨，2016)；在海水悬浮颗粒物中发现存在多种半导体矿物，其中在长江口及近海附近发现有铁的氧化物及铁的硫化物存在(范德江等，2014)。但是，目前对海洋透光层中悬浮颗粒物的半导体特性及矿物半导体与微生物间电子传递过程的研究少有报道，因此本研究将开展对日光参与下海洋透光层中矿物半导体与微生物间的交互作用及地球元素循环的调控机制等方面的探究。

主要对黄海透光层悬浮颗粒矿物组成进行分析表征，包括对矿物元素组成及矿物物相分析；通过16S rRNA测序对海水透光层微生物群落结构进行分析，构建双室体系(丁竑瑞等，2012)，研究矿物-微生物间电子传递过程，结果表明海水环境中半导体矿物能够有效参与并显著促进微生物胞外电子传递，进一步丰富自然界中半导体矿物-微生物间电子传递机制与交互作用理论。

1 实验材料和方法

1.1 样品采集及处理

自黄海透光层采集天然海水样品，海水样品取样点位于121°30′ E，34° 0′N水域，取样点水深10 m。用真空泵抽滤海水矿物样品至0.2 μm微孔滤膜上，经超纯水冲洗并烘干12 h得到矿物颗粒。

1.2 海水悬浮颗粒物矿物学表征

运用北京大学地球与空间科学学院电感耦合等离子质谱(ICP-MS，Agilent 7500 Ce，USA)测试分析悬浮颗粒物的元素组成，测试方法为全谱测试，悬浮颗粒物溶样采用酸溶法，样品稀释1 000倍。

采用北京大学物理学院场发射环境扫描电子显微镜(ESEM，Thermal Fisher Quattro S，USA)在二次电子像模式下观察悬浮颗粒物的微观形貌，并使用配有的EDX能谱仪对典型区域进行单点元素分析，测试采用低真空模式，工作电压15.00 kV，真空压强110 Pa。

使用北京大学分析测试中心X射线粉晶衍射仪(XRD，Rigaku Dmax-2400，JAPAN)对海水悬浮颗粒矿物物相进行测定分析，测试电压40 kV，电流40 mA，X射线源为Cu靶的Kα1射线(λ=1. 540 6 Å)，步长0.02°，扫描速度4°/min，扫描范围5°～90°。

利用北京大学地球与空间科学学院矿物环境功能北京重点实验室激光共焦显微拉曼光谱仪(Confocal Raman Microspectrometer，Renishaw inVia Reflex，UK)对悬浮颗粒矿物进行拉曼光谱测试，使用50 倍物镜采集信号，激光波长为532 nm，激光强度10%，束斑直径约1 μm，光栅2 400刻线，单次曝光2 s，累计5次，扫描范围100～1 340 cm-1。

1.3 微生物群落结构表征

实验使用的微生物为天然海水原始微生物群落样品，在121°30′ E，34° 0' N黄海海域、水深10 m处取3个样品点A(34-10-01，代表34° 0′ N-10 m-01号取样点)、B(34-10-02)、C(34-10-03)，针对微生物群落结构，借助16S rRNA技术完成对海水样品微生物群落测序分析，从门、纲、目、科、属5个水平对海水中的原始微生物群落进行初步种群探究。

1.4 胞外电子实验双室体系构建

利用电化学技术在双室反应装置中测试微生物的胞外电子传递能力。采用“H”型双室玻璃反应体系对海水中微生物进行监测及培养，每个室容量为135 mL，中间以直径4 cm质子交换膜(PEM，Du-pont，USA)分隔。质子交换膜使用前依次经过30% H2O2煮沸1 h、去离子水超声清洗10 min、1 mol/L H2SO4浸泡1 h处理。阳极工作电极为梳状石墨电极，阴极电极为板状石墨电极，外尺寸均为7.5 cm×3.5 cm×0.5 cm(上海弘枫石墨制品有限公司)，石墨电极依次经过1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、去离子水浸泡1 h并超声清洗；实验装置准备完毕后使用高压蒸汽灭菌器，121℃灭菌20 min。

阳极接种本源海水微生物群落，所用富集培养基为LB培养基，成分为： 10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，稀释10倍，调节pH值约为7.0；海水与培养基按照20∶1(体积比)接种富集培养两周后用于后续实验。

阴极海水悬浮颗粒矿物石墨电极制备方法：准确秤取0.08 g经海水抽滤后的悬浮颗粒矿物，加入3 mL无水乙醇稀释，超声分散5 min，加入15 μL Nafion乳液再次超声分散5 min混合均匀，玻璃棒均匀涂布于板状石墨电极的两面(有效面积7.5 cm×3.5 cm)，石墨电极使用前依次经过经1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、去离子水浸泡1 h并超声清洗，自然晾干12 h用于实验。

1.5 电学参数测试及电化学技术表征

在超净台无菌条件下按10%接种量向LB培养基中接入海水富集液并注满阳极室，使用硅胶封口；阴极室加入120 mL 0.1 mol/L KCl溶液，使用空气泵持续低速鼓入空气。实验装置置于生化培养箱(LRH-250)中，温度控制35±1℃。

实验装置阳极与阴极间连接变阻箱作为外负载，使用数据记录仪(ADC-16，Pico Technologies Limited，UK)实时监测负载电压，通过调节负载阻值获得体系电流、电压等相关电学参数，进而计算黄海透光层海水体系的极化曲线及功率密度曲线。实验体系中阴阳两极分别由UT 33B型数字万有表测定相对于饱和甘汞电极的电压，记录两极电势。

2 结果与讨论

2.1 海水悬浮颗粒物元素组成分析

ICP-MS测试结果显示海水悬浮颗粒物的主要化学元素组成为Na(848×10-3)、K(187×10-3)、Ca(149×10-3)、Mg(38.9×10-3)、Al(37.7×10-3)等，同时含有较高含量的Mn(41.9×10-3)、Fe(31.1×10-3)、Ti(3.53×10-3)等元素。Mn、Fe、Ti金属元素可能以富集金属氧化物的形式存在于悬浮颗粒物中，为证实此推测对悬浮颗粒物样品进行ESEM配以EDX能谱测试分析。

将干燥后的悬浮颗粒物进行环氧树脂包埋制样，用于环境扫描电子显微镜下悬浮颗粒物的微形貌观察。ESEM二次电子像中悬浮颗粒物呈团絮状，部分悬浮颗粒物外围被有机质包裹，典型的具有较规则几何外形的矿物颗粒呈四方锥状、薄板状(图1a)、厚板状(图1c)；配以EDX能谱数据显示(图1b、1d), 海水悬浮颗粒物中主要元素分别为O、Si、C、K、Al等，在部分具有较规则几何外形的矿物中发现含量相对较高的Fe、Ti金属元素，这些矿物的晶体形貌与针铁矿、锐钛矿、金红石的晶形相吻合。为进一步确定悬浮颗粒物的主要矿物物相及富含Fe、Ti元素的矿物物相，对其进行了XRD及显微拉曼测试分析。

图 1 ESEM下悬浮颗粒物的微形貌(a、c)及EDX能谱数据(b、d)Fig. 1 Morphology of suspended particulate under ESEM (a, c) and data of EDX (b, d)

2.2 海水悬浮颗粒物物相鉴定

显微拉曼光谱测试明确发现悬浮颗粒矿物中含有锐钛矿、金红石、板钛矿、针铁矿等多种铁、钛半导体矿物(图3)。锐钛矿相中每个晶胞含有2个TiO2分子，拉曼活性光学模具有3个Eg振动模式(148、200、633 cm-1)、1个B1g(395 cm-1)和1个A1g(516 cm-1)振动模式(Ohsakaetal., 1978)。板钛矿相TiO2属于斜方晶系，每个晶胞中含有6个TiO2分子，板钛矿相中154、220 cm-1分别为A1g、B1g振动模，329、395、475 cm-1为B2g振动模(Tompsettetal.,1995)。金红石相TiO2属于四方晶系，每个晶胞中含有2个TiO2分子，声学模245 cm-1振动模式，中心对称晶格振动模式为1个B1g(143 cm-1)、1个Eg(446 cm-1)、1个A1g(610 cm-1)和1个B2g拉曼活性振动模(Samara and Peercy, 1973)。针铁矿为斜方晶系，其中265、272、384、463 cm-1分别为针铁矿的特征峰(Thibeauetal., 1978； De Fariaetal., 1997)。前人已发现并报道锐钛矿、金红石、板钛矿、针铁矿等为半导体矿物(Bickleyetal., 1973； Andreozzietal., 2003； Kandieletal., 2010； Tsukamotoetal., 2012； Xieetal., 2013)。

图 2 海水中悬浮颗粒物的XRD分析结果Fig. 2 XRD patterns of suspended particulate in marine

2.3 海水微生物群落结构分析

针对3个取样点A(34-10-01)、B(34-10-02)、 C(34-10-03)的微生物样品，通过16S rRNA技术对海水样品微生物群落进行测序，分析结果表明，门、属水平相同深度的3个不同取样点微生物种类差异不大，均显示在门水平(图4)主要含有变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、浮霉状菌门Planctomycetes、酸杆菌门Acidobacteria、蓝藻门Cyanobacteria、绿弯菌门Chloroflexi及芽单胞菌门Gemmatimonadetes等微生物，均为自然界常见的微生物门类，与丁斯予等(2019)、窦妍等(2015)在黄海水样检测的微生物菌群结果一致。根据菌群结构分析，水样中的优势菌群为变形菌门Proteobacteria，次优势菌群为放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、浮霉状菌门Planctomycetes等。海洋拟杆菌门细菌与DNA转化、脂类和蛋白质等有机物质的转换相关，这些有机物质的吸收与利用与水体环境中碳循环过程密切相关(Cottrell and Kirchman, 2000； O’Sullivanetal., 2002)。海洋浮霉状菌门是海洋环境中重要微生物，对元素生物地球化学循环起着重要的作用(黄佩蓓等，2014)。

图 3 海水中半导体矿物的拉曼光谱Fig. 3 Raman spectra of semiconductive minerals in marine

图 4 门水平微生物群落结构图Fig. 4 Microbial species in phylum level

属水平上3个取样点中CandidatusActinomarina、Woeseia、Fluviicola、Lactobacillus菌属均占较高比例(图5)，水样中优势菌属为Woeseia、Fluviicola。Woeseia属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧型，生长条件需要盐类物质(Poddaretal., 2014； Duetal., 2016)；Fluviicola为一种严格好氧菌，2000年被发现于英国加的夫塔夫河，此菌属于革兰氏阴性菌(O’Sullivanetal., 2005)。由于海洋中绝大多数微生物尚不能用现有的培养方法和技术进行分离培养(穆大帅等，2017)，因此样品中绝大多数属水平上的微生物仍为未知、未识别或未培养状态。

2.4 矿物-微生物胞外电子转移特性分析

实验中构建双室体系(图6)将矿物端员与微生物端员分隔开，进一步分析每个端员发生的氧化还原过程，进而明确海水中微生物端电子传递过程以及在矿物参与下微生物-矿物的交互作用。

图 5 属水平微生物群落结构图Fig. 5 Microbial species in genus level

图 6 双室实验装置示意图Fig. 6 Schematic diagram of double-chamber experimental system 不同颜色圈点示意不同种类微生物； PEM—质子交换膜； Data logger—负载电压数据监测； R—外接电阻 Little cycles with different colors represent different kinds of microorganisms; PEM—proton exchange membrane； Data logger—load voltage； R—external resistor

实验装置在生化培养箱中培养15天后用于测试，根据体系实测的电流-电压数据(Loganetal., 2006)绘制极化曲线与功率密度曲线(图7)，经拟合计算发现：阴极为石墨电极时，体系的开路电压为330.80 mV(表1)，最大功率为8.376 9 mW/m2；阴极石墨板涂布海水透光层悬浮颗粒物后，反应体系开路电压显著提升约100 mV，最大输出功率比原体系有显著提高，为原体系的1.44倍，但两个体系内阻变化较小，推测内阻主要由装置本身所决定，在反应体系未调整情况下变化不显著。当实验体系为氧气作为电子受体时，体系的极限电流为0.233 7 mA，加入悬浮颗粒矿物后体系的极限电流为0.296 2 mA，说明更多微生物胞外电子从阳极传出，其代谢活动得以增强，实验结果表明海水原位的微生物具有胞外电子传递能力。

图 7 极化曲线与功率密度曲线Fig. 7 Polarization curves and power density curves

表1 反应体系电子转移过程电学参数Table 1 The electrical parameters of electron transfer in reaction systems

3 结论

以黄海海水透光层为研究对象，围绕悬浮矿物组成及半导体矿物-微生物电子传递问题进行初步探究，借助现代矿物学测试技术分析海水透光层悬浮矿物成分，利用16S rRNA测序技术研究海水原位微生物群落结构，构建双室海水悬浮矿物-微生物研究体系揭示海水透光层中半导体矿物能有效参与并显著促进其原位微生物胞外电子传递，这一电子传递过程会伴随并影响生物地球化学元素的循环过程。

(1) 黄海透光层中的悬浮颗粒物主要含有Si、O、Na、K、Ca、Al等元素，且含有较高含量的Mn、Fe、Ti等金属元素；悬浮颗粒物的主要矿物物相为石英、钠长石、方解石、云母和绿泥石等，且含锐钛矿、金红石、板钛矿、针铁矿等多种铁、钛半导体矿物。

(2) 黄海透光层的微生物群落在门水平上主要含有Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Acidobacteria、Cyanobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes等；属水平上主要含有CandidatusActinomarina、Woeseia、Lactobacillus、Fluviicola等。其中海洋拟杆菌门Bacteroidetes与水体环境碳循环密切相关，海洋浮霉状菌门Planctomycetes对元素生物地球化学循环起重要作用。

(3) 双室电学体系研究表明，阴极矿物可以获取来自阳极微生物传出的电子，同时促进体系中电子流动并增强微生物的胞外电子还原作用。海水中的半导体矿物可与氧气共同作为微生物新陈代谢活动过程中的电子终端受体，有利于提高微生物能量代谢效率并拓展其能量传递方式。