PCPA失眠大鼠脑干NG2细胞和NMDA受体的表达及酸枣仁汤的干预作用

郭海波，全 睿，滕 柳，石 鹏，王 慧

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

睡眠与胶质细胞关系密切[1]。NG2细胞作为新型胶质细胞[2]，被认为是一种动态的前体胶质细胞群，它在体内不断分化和迁移，在大脑不同区域及不同发育时间广泛存在。它与神经元之间形成突触联系[3]，参与突触可塑性和调节、支持、营养神经元[4]，在神经信息传递中起着重要作用。睡眠不足可以影响髓鞘形成相关基因的表达，而NG2细胞作为少突胶质细胞前体细胞，也受到睡眠的调节和影响[5]。

对氯苯丙氨酸(P-chlorophenylalanine，PCPA)作为五羟色胺合成酶——色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)的拮抗剂，能够阻断脑内五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)合成，减少脑内5-HT含量，使动物出现失眠。利用PCPA建立失眠动物模型，因效果确切、操作方便受到诸多学者的青睐[6]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是兴奋性氨基酸——谷氨酸(Glutamate，Glu)的离子型受体，它在中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)表达广泛，调控突触可塑性和神经元长时程增强效应[7]，与学习记忆关系密切，对生物发育过程极为重要[8]。在神经退行性疾病、脑缺血等发生机制中也起到重要作用[9]。有研究显示NMDA受体功能低下可导致小鼠睡眠-觉醒障碍，昼夜节律延长，入睡延迟[10]；还有研究显示，睡眠剥夺可导致脑扣带回前部NMDA受体亚基表达水平显著上调[11]。酸枣仁汤(Suanzaoren Decoction，SZRD)是中国汉代著名医家张仲景的经典方剂，现代研究显示酸枣仁汤治疗失眠的机制与调控脑内神经递质水平和抑制胶质细胞激活有关[12]，但酸枣仁汤干预失眠的机制是否与NG2细胞和NMDA受体相关，目前尚不清楚。本研究探讨PCPA导致的失眠经酸枣仁汤治疗后脑干NG2细胞和NMDA受体表达的变化，旨在进一步揭示酸枣仁汤治疗失眠的可能机制。

1 材料与试剂

1.1 动物

健康SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠50只，体重(200±20)g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号NO.SCXK(湘)2014-0011。在安静、自然光、温度保持恒定(22±2)℃的环境中随意获取食物和水，饲养7天后进入实验。饲养和实验条件均符合贵州中医药大学动物伦理和实验相关要求。

1.2 器材、试剂和药物

7500实时荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司)；NP80超微量分光光度计(德国Implen公司)；PCPA(C-6506，Sigama公司)；中药材(酸枣仁、知母、茯苓、川芎、炙甘草)购自北京同仁堂贵阳药店。Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(赛默飞世尔科技有限公司)，qPCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

2 实验方法

2.1 药物制备

SZRD处方参照《方剂学》第5版教材：酸枣仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g组成。称取以上五味药材10剂共460 g，加8倍量水，浸泡1 h后煎煮1 h，沸后30 min纱布滤过。药渣加6倍水煎煮，沸后20 min纱布滤过，合并两次滤液，浓缩成150%浓度(含生药量15 g/mL)的水提物，分装灭菌，4 ℃冰箱储存备用[12]。

PCPA溶液制备：将PCPA按照350 mg/kg计算总用量，称量PCPA粉末，倒进灭菌后的研钵内，加少量生理盐水研磨30 min，边研磨边加水，直至达到所需浓度。将PCPA悬浮液收集至试剂瓶，冰箱4 ℃保存备用[6]。

2.2 分组、给药方法和造模

随机分为5组：正常组、对照组、PCPA组、SZRD组、PCPA+SZRD组，每组10只。正常组不给任何处理；对照组腹腔注射生理盐水；PCPA组和PCPA+SZRD组腹腔注射PCPA 350 mg/kg，SZRD组腹腔注射等体积的生理盐水。腹腔注射均为每天1次连续6天。第7天开始，正常组不做处理，对照组和PCPA组灌胃生理盐水，SZRD组和PCPA+SZRD组灌胃SZRD。酸枣仁汤灌胃按照7.5 g/kg以10 mL/kg体积，每天1次，连续8天。8天后取材进行RT-PCR检测。腹腔注射PCPA 3天后可见大鼠昼夜节律消失，白天活动增加，皮毛无光泽及脱毛增加，体重增长缓慢，攻击性增强等，整体观察和对照组形成鲜明对比，表明失眠模型复制成功。

2.3 取材

大鼠在末次给药2 h后腹腔注射苯巴比妥1.25 mg/kg麻醉后，于冰上快速取出脑组织，分离脑干，迅速将脑干置于4%多聚甲醛标本瓶中，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

2.4 引物设计

应用引物设计软件Primer 5.0设计RT-PCR所需相关特异性引物，交由上海生工生物技术服务有限公司合成，见表1。

表1 引物序列和片段大小

2.5 总RNA的提取，cDNA的合成和反应条件

Trizol法提取总RNA，用NP80超微量分光光度计测定、计算RNA纯度和浓度，A260/A280比值在1.8～2.0为纯度合格，总RNA置于-80 ℃保存备用。根据RNA浓度计算逆转录加入量，严格按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录操作，得到cDNA，-20 ℃保存备用。总体积采用20μL反应体系进行扩增，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因，反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。试验样品每组做3个重复。

2.6 统计学处理

3 结果

结果显示(见表2)，与对照组比较，PCPA组NG2 mRNA的表达升高(P<0.05)，NMDA受体mRNA的表达显著升高(P<0.01)，5-HT1A受体mRNA表达下降(P<0.05)，差异有统计学意义。与PCPA组比较，PCPA+SZRD组NG2细胞、NMDA受体mRNA的表达下降(P<0.05)，5-HT1A受体mRNA的表达升高(P<0.05)，差异有统计学意义。正常组NG2、NMDA受体、5-HT1A受体表达量和对照组比较无统计学意义(P>0.05)。

分组例数(n)NG2NMDAR5-HT1AR正常组100.946±0.1190.995±0.1051.614±0.337对照组100.995±0.1561.065±0.1591.715±0.279PCPA组101.315±0.051∗1.638±0.081∗∗1.230±0.135∗SZRD组101.004±0.1301.277±0.1171.722±0.118PCPA+SZRD组101.107±0.023#1.362±0.154#1.627±0.109#

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。与PCPA组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

5-HT是脑内最重要的单胺类神经递质，与睡眠关系密切。PCPA通过拮抗色氨酸羟基化而阻断和耗竭脑内5-HT的合成[13]，进而导致失眠。本实验采用腹腔注射PCPA成功制作大鼠失眠模型，观察了SZRD对失眠大鼠脑干NG2、NMDA受体的表达，以及与睡眠最密切的5-HT受体亚型之一：5-HT1A受体的变化。结果显示，腹腔注射PCPA后，失眠大鼠脑干NG2、NMDA表达升高，5-HT1A表达下降。SZRD治疗后，NG2、NMDA受体表达下降，5-HT1A表达升高。而对照组与正常组无显著差异，说明SZRD对正常大鼠脑干NG2、5-HT1A、NMDA受体无明显作用。

目前所知，所有的动物都需要睡眠[14]，睡眠障碍可导致不良后果，其重要性无需多言，但睡眠对NG2细胞的影响目前知之甚少。NG2细胞被认为是存在于CNS的第四个胶质细胞群[2]，它与神经元之间存在着经典或非经典的突触联系。脑干网状结构的Glu能系统参与了觉醒的发生。在新生鼠和成年小鼠海马切片中发现存在着神经元-NG2细胞的Glu能突触[15]。Glu在CNS中的作用主要是通过其受体介导。Glu受体分为两类：离子型受体和代谢型受体。NMDA受体属于离子型受体，主要作用是参与生理状态下的突触可塑性和病理状态下的兴奋性毒性[16]。NG2细胞可表达多种Glu受体，其中就包括NMDA受体[17]。研究显示，NMDA受体与睡眠关系密切，它被阻滞后可影响睡眠[18]，而睡眠障碍也可以影响NMDA受体的表达[19]。NMDA还是5-HT1A、2A、2C受体的重要靶标[20-21]，有研究显示通过与NMDA相互作用，不同的5-HT受体亚型调节前额皮质神经元放电存在着差异，5-HT受体对兴奋性的复杂效应被选择性改变[22]。5-HT和NMDA受体的信号传导均参与了大脑的认知和情绪的调节，这通常与焦虑、失眠和抑郁等精神障碍相关。大鼠腹腔注射PCPA导致脑内5-HT浓度下降以后脑干NG2和NMDA受体表达增加，极有可能与离子通道信号转导有关。本课题组以往研究表明，PCPA导致的失眠可使大鼠大脑微透析液中的Glu含量升高[23]，Glu的大量升高会过度激活突触后NMDA受体，使其表达增加，NMDA受体表达增加可导致离子通道开放，产生Ca2+内流，以此影响神经细胞信号的转导，参与大脑认知和情绪调节。NG2细胞可以通过所表达的受体对相关神经信号作出反应，进而参与睡眠剥夺的过程。但5-HT合成减少后NG2信号传递的机制仍需要进一步明确。

有研究显示，NG2细胞不仅可以作为少突胶质细胞前体细胞参与髓鞘的形成和损伤的修复[24]，同时与CNS损伤，如脱髓鞘、外伤、缺血和胶质瘤形成等病理状态密切相关[25]；但NG2细胞仍不同于少突胶质细胞，二者对应激反应的基因表达有着明显的区域特异性[26]。成人NG2细胞在机械损伤、兴奋性毒性和病毒感染等其它CNS损伤后也可被激活和增殖[27]，神经/胶质抗原2(NG2)还是病理状态下周围细胞活化的早期标志[28]，在神经受损后，NG2细胞的增殖能力迅速增加并向组织损伤区域迁移[29]，作为关键成分在损伤神经周围形成高阻抗胶质瘢痕，在神经损伤修复中发挥着积极作用。有研究显示，睡眠不足可以抑制髓鞘形成相关基因的表达[30]，对NG2细胞的分化和增值有着不同影响[31-32]。PCPA导致睡眠剥夺后NG2细胞表达增加，可能还与NG2细胞对应激的高度反应性相关，因其功能之一就是响应CNS的损伤在神经系统稳态中发挥作用。

综上所述，PCPA导致的失眠可引起大鼠脑干NG2细胞和NMDA受体表达增加，酸枣仁汤干预后，NG2细胞和NMDA受体表达下降，这有可能是酸枣仁汤治疗失眠的靶点之一，从而进一步揭示了酸枣仁汤治疗失眠的潜在机制。利用现代药理学方法对中药复方的作用机制进行研究有助于我们深入、系统地了解中药复方的药效基础和作用机理，可以有效促进中医药现代化。