帕利亚姆血清群病毒一步法RT-PCR 检测技术的建立

李占鸿，廖德芳，杨振兴，张 洁，肖 雷，李华春*，杨 恒*

（1.云南省畜牧兽医科学院 热带亚热带动物病毒重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650224）

2012 年以来本实验室相继在云南省、广东省及广西壮族自治区相继分离出CHUV、BCV 与DAV 3种PALV 血清型病毒株[7]。血清学调查结果显示我国内蒙古、新疆、甘肃、江苏、湖北、广西、云南和海南等省自治区牛羊中CHUV 抗体阳性率介于6%（江苏）～48.65%（海南）之间[8-9]。以上研究结果表明PALV 在我国流行范围遍及由南（海南）至北（内蒙），由东（江苏）至西（新疆）的广泛区域，对我国牛羊养殖业的健康发展构成了潜在的威胁。

PALV 在基因组结构以及病毒形态上与同属的蓝舌病病毒（Bluetongue Virus，BTV）和鹿流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）十分相似。PALV 的基因组由Seg-1～Seg-10 等10 个基因节段构成，可编码VP1～VP7 等7 种结构蛋白与NS1～NS3 等3 种 非 结 构 蛋 白[10-11]。Seg-7 编 码 的VP7蛋白构成PALV 的内层衣壳，VP7 蛋白为环状病毒属病毒的群特异性抗原，可诱导产生病毒的群特异性抗体，其核苷酸和氨基酸序列在不同血清型病毒株之间高度保守，是鉴定环状病毒种属最为重要候选靶序列之一[12-13]。

根据我国PALV 流行株的序列特征，建立准确、可靠的PALV 核酸检测方法对我国PALV 感染的疫病防控工作具有重要意义。目前，国内尚未报道针对我国流行的CHUV、BCV 和DAV 3 种血清型PALV群特异性RT-PCR 检测方法。本研究根据我国CHUV、BCV 和DAV 3 种PALV 血清型病毒株的Seg-7基因序列信息，设计针对PALV 的群特异性扩增引物，建立针对国内流行PALV 的群特异性一步法RT-PCR检测方法，为我国PALV的快速检测和疫病流行病学调查等提供了一种有效可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株、血液样品、细胞与质粒 2012 年～2016 年，本研究室从云南省、广东省与广西自治区的牛羊虫媒病毒监控点分离的19 株PALV[7]及相应的PALV 核酸阳性EDTA 抗凝血液样品见表1；BTV-1/Y863[14]、EHDV-10 型（YNSZ/V277/2013）病毒株[15]与广西环状病毒（Guangxi orbivirus，GXOV）[16]由本实验室分离保存；非洲马瘟病毒（African horse sickness virus，ASHV）灭活疫苗购自世界动物卫生组织（OIE）参考实验室Onderstepoort Veterinary Institute：South Africa；BHK-21 细胞由本实验室保存；CHUV 病毒株（CHUV/V144/2014）Seg-7 全长基因序列克隆质粒pLB-CHUV/V144/Seg-7 由本实验室构建保存。

1.2 主要试剂 一步法RT-PCR 试剂盒、病毒RNA/DNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒与DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司；T7 启动子RNA 体外转录试剂盒购自Promega 公司；MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提试剂盒与RNA 纯化试剂盒购自Thermo 公司；XbaⅠ限制性内切酶购自NEB 公司。

1.3 引物设计 根据本研究室前期获得的中国PALV 株的序列[7]以及GenBanK 登录的其它国家PALV 株的序列，选择PALV 群保守基因Seg-7，利用Primer5.0 设计特异性RT-PCR 扩增引物： PALVS7-F：5'-GAAACATCAATYCAGCAAGGAAC-3'/PALVS7-R：5'-TCATACATAAGGTCGCACGCAA-3'，预 期扩增DNA 片段长度为388 bp，引物由上海捷瑞公司合成。

1.4 RNA 标准品的制备 使用XbaⅠ内切酶将pLBCHUV/V144/Seg-7 质粒线性化后，采用T7 启动子RNA体外转录试剂盒按说明书体外转录，经DNAseⅠ酶消化后，利用RNA 纯化试剂盒进行转录ssRNA 的纯化。将纯化的PALV Seg-7 ssRNA 经电泳检测，采用Nanodrop ND-2000 测定核酸浓度，计算RNA 拷贝数后分装于-80 ℃保存备用，作为RNA 标准品。

1.5 一步法RT-PCR 扩增 使用病毒RNA/DNA 提取试剂盒提取CHUV/V144/YN/2012 株、BCV/V256/GD/V2015 株、DAV/V157/YN/2015 株核酸作为模板，参照One Step PrimeScript RT-PCR Kit 产品说明书，采用25 μL 反应体系，利用方阵法对引物浓度（0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L）与退火温度（55 ℃～62 ℃）进行优化，确定最佳反应条件，经琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测后，将阳性扩增产物胶回收纯化后测序分析。

表1 2012 年～2016 年我国分离的PALV 株信息Table 1 The basic isolation information of Chinese PALV strains isotated from 2012 to 2016

1.6 特异性试验 使用病毒RNA/DNA 提取试剂盒提取CHUV、BCV、DAV、BTV-1、EHDV-10、GXOV、ASHV 灭活疫苗核酸为模板，同步提取空白BHK-21细胞核酸，作为阴性对照，按照1.5 确立的最佳反应条件进行RT-PCR 扩增，评估PALV 一步法RT-PCR 方法的特异性。

从图1还可看出，加法口算和减法口算的发展趋势较为一致．在这7种口算中，add12、jadd12、2-1退位、2-1不退位这4种广度为3类型的加减法口算，学生在四~五年级的口算速度发展最快；而口算广度为2的3种口算类型中，add11和jadd11在一~三年级发展最快，1-1不退位在二~三年级发展最快．由此可说明，小学二年级和四年级是口算速度发展的关键期，其中口算广度为2的发展关键期在二年级，而口算广度为3的发展关键期在四年级．

1.7 敏感性试验 将PALV Seg-7 ssRNA 标准品10 倍倍比稀释，分别取6.9×108拷贝/μL～6.9×101拷贝/μL 的RNA 为模板，经一步法RT-PCR 扩增，确定PALV一步法RT-PCR 检测方法的敏感性。

1.8 分离病毒的RT-PCR 检测 使用MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提试剂盒提取表1 所示的19 株PALV病毒核酸，利用本研究建立的PALV 群特异性一步法RT-PCR 进行扩增，分析该方法是否具有普遍适用性，能否有效检测不同时间、不同地点分离的PALV。

1.9 血液样品的RT-PCR 检测 为评估本研究建立的方法能否用于检测临床血液样品中的PALV 核酸。使用MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提试剂盒提取表1 所示的19 株PALV 对应的EDTA 抗凝血液样品核酸，利用本研究建立的PALV 群特异性一步法RT-PCR 方法进行检测。

2 结 果

2.1 RNA 标准品的制备 使用限制性内切酶XbaⅠ将PLB-CHUV/V144/Seg-7 质粒线性化后体外转录，通过DNAseⅠ酶消化去除残留的线性化质粒，以RNA 纯化试剂盒纯化后经电泳检测，结果显示转录出大小约1 150 bp 的ssRNA 条带，与预期相符（图略）。测定ssRNA 核酸浓度为450 ng/μL。根据RNA拷贝数计算公式“ssRNA 拷贝数（拷贝/μL）=（6.02×1023）×RNA 浓度（ng/μL）×10-9/（RNA length×340）”，计算出转录的PALV Seg-7 ssRNA 拷贝数为：6.9×1011拷贝/μL 作为标准品。

2.2 PALV 一步法RT-PCR 检测方法的建立 分别对PALV 一步法RT-PCR 的退火温度与引物浓度进行优化，优化结果为：最佳引物浓度为0.8 μmol/L，最佳退火温度为56 ℃。反应体系为：12.5 μL 2×1 step Buffer，1 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix，上、下游引物各1 μL（0.8 μmol/L），5 μL RNA 模板，加水 补 齐 至25 μL；PCR 反 应 程 序 为：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃30 s，35 个循环；72 ℃10 min。以提取的CHUV、BCV 与DAV的核酸为模板，进行一步法RT-PCR 扩增，结果显示扩增产物约为388 bp，符合预期大小（图1）。将扩增产物的测序结果在NCBI 网站进行BLAST 比对分析，结果显示3 种扩增产物与PALV Seg-7 基因的核酸序列相似度均在98%以上，表明PALV 一步法RT-PCR 检测方法初步建立。

图1 CHUV、BCV 与DAV Seg-7 基因的RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification for the Seg-7 gene of CHUV,BCV and DAV by RT-PCR

图2 RT-PCR 的特异性试验结果Fig.2 Specificity test of the RT-PCR

2.3 特异性试验结果 分别以提取的CHUV、BCV、DAV、BTV-1、EHDV-10、GXOV 与ASHV 灭活疫苗的RNA 为模板，经一步法RT-PCR 扩增，结果显示仅PALV 的核酸模板扩增出符合大小的目的片段，BTV、EHDV、GXOV 和ASHV 疫苗核酸扩增结果均为阴性（图2），表明该方法具有较强的特异性。

2.4 敏感性试验结果 将PALV Seg-7 ssRNA 标准品10 倍倍比稀释，分别取6.9×108拷贝/μL～6.9×101拷贝/μL 的核酸为模板，经一步法RT-PCR 扩增。结果显示，该方法对Seg-7 ssRNA 的检测下限为6.9×101拷贝/μL（图3）。表明本研究建立的PALV一步法RT-PCR 检测方法具有较高的敏感性。

2.5 分离病毒的检测 对本实验室分离并保存的12 株CHUV、4 株DAV 与3 株BCV 共计19 株PALV 病毒株经一步法RT-PCR 检测，结果显示19 株病毒的检测结果均为阳性，表明该方法可有效检测不同时间、不同地点分离的PALV。

2.6 血液样品检测结果 提取表1 所示的19 株PALV对应的EDTA 抗凝血液样品核酸经一步法RT-PCR检测，结果显示19 份血液样品的检测结果均为阳性，与病毒分离结果[7]完全一致（表2），表明本研究建立的PALV 群特异性RT-PCR 检测方法可用于检测临床血液样品。

图3 RT-PCR 的敏感性试验Fig.3 Sensitive test of the RT-PCR assay

表2 血液样品RT-PCR 检测结果与病毒分离结果的比较Table 2 The comparison of detection results for both RT-PCR and virus isolation

3 讨 论

目前，PALV 的检测方法主要包括：病原分离、血清抗体检测及病毒核酸检测等方法。其中病原分离存在工作量大、耗时长等缺点，不便于病原的快速检测和开展大规模流行病学调查；抗体检测方法包括经典的病毒中和试验[12]、琼脂免疫扩散试验[17]、竞争ELISA[18]等，虽然以上血清抗体检测方法可同时进行大量样品的检测，但是血清抗体的产生相对于病毒感染存在一定的滞后性，因此不利于疫病的早期诊断和防控[19]。Aradaib 建立的PALV 核酸巢式PCR 检测方法虽然具有较高的敏感性，但需要二次PCR 扩增，存在耗时较长，容易出现假阳性结果的问题；一步法RT-PCR 检测方法，反转录与PCR 扩增一步完成，减少了操作步骤，缩短检测时间的同时，降低了检测过程中发生污染的可能性，提高了检测结果的准确性。

PALV 与BTV、EHDV、GXOV 同属于环状病毒属成员，均可通过库蠓的叮咬传播感染牛；ASHV虽仅感染马属动物，但遗传进化分析表明，ASHV与PALV 具有最近的亲缘关系[20]。因此保证PALV 群特异性检测方法的特异性，对疫病的准确诊断十分重要。特异性试验结果显示本研究建立的PALV 特异性RT-PCR 检测方法对BTV、EHDV、GXOV 与ASHV 均无扩增，具有较强的特异性。

关于RNA 病毒RT-PCR 检测方法的敏感性试验，有文献报道使用倍比稀释的重组质粒或倍比稀释的病毒液提取核酸作为模板进行测试。但使用重组质粒为模板进行RT-PCR 扩增，并不能反映RT-PCR 检测方法对RNA 模板的真实扩增效率；同时，将病毒液高倍稀释后可能存在核酸提取效率降低的问题[21-22]。因此本研究采用体外转录的方法制备PALV Seg-7 ssRNA 作为标准品进行敏感性试验，得出的结果更为准确可靠。

由于存在内外两层衣壳蛋白的保护，环状病毒属的病毒粒子可在4 ℃冷藏条件下保藏数年之久[7,23]。在对2012 年～2016 年采集的19 份分 离出PALV 的血液样品进行检测时，结果显示CHUV/SZ187、CHUV/V144 与CHUV/V078 株等3 份血液样品扩增条带较弱，推测可能是血液样品在4 ℃存放时间过长，致使血液中PALV 的病毒核酸发生部分降解，导致RT-PCR 扩增条带较弱。本研究建立了针对国内流行PALV 的群特异性一步法RT-PCR 检测技术，该方法可对细胞培养的PALV 及PALV 核酸阳性血液样品进行检测，为我国PALV 的快速检测和疫病的早期诊断、流行病学调查等提供了一种有效可靠的技术手段。