牙周基础治疗对慢性牙周炎患者非刺激性全唾液、龈沟液及血清中基质金属蛋白酶-13水平的影响

杨琦 穆森 詹渊博 闫颖 王艳 张瑞敏

牙周炎是一种由细菌感染和宿主免疫反应两者之间相互作用所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病。细菌感染导致白细胞活性升高与细胞因子分泌增加, 及基质金属蛋白酶(MMP)与类花生酸的增加, 从而导致宿主介导牙周支持组织的破坏，其中MMP在牙周组织的破坏中起重要作用[1]。MMP-13作为MMP家族的第三成员，是一种由成纤维细胞、软骨细胞、破骨细胞、角化细胞、巨噬细胞、牙髓细胞和内皮细胞等表达的具有较强溶胶作用的胶原酶[2]。其表达由人β牙龈成纤维细胞中的转化生长因子3型(TGFβ3)诱导，并被2型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2)抑制[3]。MMP-13的作用底物最广，除可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ天然胶原酶、韧粘素、纤连蛋白等，还能使软骨的纤维结构受损，造成骨和软骨的破坏[4]。本实验通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)，分析牙周炎患者治疗前后龈沟液、唾液以及血清中MMP-13的变化及其与临床指数的相关性，以探讨MMP-13与牙周炎发病机制、诊断及治疗预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象的选择

1.1.1 实验组 共有20 名患者(10 名男性，10 名女性，年龄30～59 岁)，选自哈尔滨医科大学附属第二医院牙周黏膜科。在参与之前，向所有患者充分解释了本实验目的和程序，并且每个患者均签署书面知情同意书。受检者符合1999 年牙周病分类国际研讨会制定的标准[5]，同时具备以下条件者：①没有全身性疾病者(糖尿病，心脏病，免疫性疾病等可能影响牙周病病程的疾病)；②在近6 个月内未做过牙周基础治疗者；③近6 个月内未使用抗生素，抗炎药物或免疫抑制药物等可影响牙周表现或影响研究结果者；④无吸烟(包括从不吸烟和至少戒烟10 年以上者)习惯者；⑤全口余留牙大于10 个以上者均可纳入。

1.1.2 对照组 选取本院各科同意参加本研究的工作人员及患者中的牙周健康者20 例 (男10 例,女10 例,年龄25～52 岁 )。受检者符合以下条件：①无系统性疾病；②近3 个月未使用抗生素及免疫制剂；③近3 个月未进行牙周药物及手术治疗；④妇女未妊娠；⑤龈沟深度<2 mm，龈沟探诊不出血，无明显牙龈退缩。所有受检者均签署知情同意书。

1.2 实验设计

初诊时进行临床指标的检测并采集 GCF、非刺激性唾液以及血清, 然后分别进行龈上洁治和龈下刮治等牙周基础治疗, 同时给予口腔卫生指导。治疗结束后6 周再次检测临床指标和GCF、非刺激性唾液和血清的样品采集。所有牙周炎患者的牙周基础治疗均由同一口腔医师完成。在牙周基础治疗后没有使用抗生素等任何其他药物。

1.3 临床指标的检测

检测待测牙的出血指数(bleedingindex，BI)，牙周探诊深度(probingdepth，PD)，临床附着丧失指数(clinicalat-tachmentloss，CAL)等。临床指标均检测牙齿的颊侧近中、颊侧中央、颊侧远中、舌侧近中、舌侧中央、舌侧远中6 个位点并取其平均值。临床检查均由同一名口腔医师在统一光源下使用统一规格器械完成。

1.4 唾液标本采集

由同一口腔医师收集所有参试者的非刺激性全唾液，采集时间为上午9：00～10：00，采集前禁食2 h。采集时要求参试者用无菌蒸馏水含漱3 min后全部吐出，保持不吞咽、不说话并静坐10 min，用5 ml吸引器吸取自然状态下非刺激分泌的全唾液5 ml，注入无菌Eppendorf管。所得的样本立即送实验中心，14 000 g/min离心5 min，-80 ℃冻存统一待测。

1.5 龈沟液(GCF)采集

首先选取1 个上前牙的近远中邻面位点和1 个第一磨牙近远中邻面位点，且牙齿颈部无龋损和充填体。刮除其龈上大块牙石菌斑，用棉卷隔湿待测牙并轻轻吹干牙面，然后用Whatman滤纸制成的2 mm×10 mm滤纸条分别轻轻插入每个待测牙的龈沟或牙周袋内，直到感觉有轻微阻力为止，静置30 s后取出(如被血液污染则除)，立即放入Eppendorf管中密封于-80 ℃冰箱保存待测。以上操作由同一口腔医师完成。

1.6 血清标本采集

隔夜空腹后的清晨或上午抽取被纳入对象的肘正中静脉血4 ml，4 ℃静置待血液充分凝固后用台式离心机以3 000 r/min，离心10 min(离心半径为8 cm)，分离血清后分装，-80 ℃冻存统一待测。

1.7 ELISA方法检测非刺激全唾液、龈沟液和血清中MMP-13水平

-80 ℃冰箱中取出GCF、唾液、血清样本，放置室温下解冻，装有GCF样本的EP管中分别加入200 μl去离子水在室温下震荡10 min，4 ℃低温离心机中以14 000 r/min离心5 min(离心半为10 cm)，取上清液备用。ELISA试剂盒测定非刺激性全唾液、龈沟液及血清中 MMP-13水平(ELISA试剂盒购自武汉市BOSTER生物科技有限公司)，检测步骤严格按照所附说明书操作，并用酶标分析仪在450 nm处测量各孔吸光度(A值)，制作标准曲线，并根据样品A值从而计算样本中MMP-13的水平进行比较。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 6.01软件，若各组数据符合正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析；不符合正态分布或者方差不齐，则采用秩和检验：牙周基础治疗前、后各组间MMP-13水平及临床指标比较采用配对样本t检验和Wilcoxon秩和检验进行分析；治疗前、后与健康对照组间MMP-13水平及临床指标比较采用独立样本t检验和Mann-Whitney-U检验进行分析。采用spearman相关性分析分析疾病组前后非刺激性全唾液、血清及龈沟液中MMP-13水平与PD、CAL、BI的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙周基础治疗前后临床指标的比较

慢性牙周炎基础治疗后 BI、PD 均有显著性改善(P<0.05)；CAL未见明显改变(P>0.05)(表 1)。

Tab 1 Clinical parameters before and after treatment n=20)

2.2 MMP-13水平比较

在非刺激性全唾液中患者治疗前、 后MMP-13水平均高于健康对照组(P<0.05)，治疗后明显降低(P<0.05)(表 2)。治疗后降低不显著(P>0.05)

在龈沟液中，患者治疗前MMP-13水平显著高于治疗后(P<0.05)，治疗前水平高于健康对照组(P<0.05)，治疗后与健康组差异不大(P>0.05)(表 2)。

在血清中，患者治疗前MMP-13水平显著高于治疗后(P=0.004 3)，患者治疗前MMP-13水平高于健康对照组(P<0.05)； 而慢性牙周炎患者治疗后MMP-13水平与健康对照组相比差异不大(P>0.05)(表 2)。

Tab 2 Comparison of MMP-13 levels before and after the treatment( pg/ml)

注：患者治疗前与健康对照组相比，①P<0.05，患者治疗后与健康对照组相比，②P>0.05

2.3 各组临床指标与非刺激性全唾液、龈沟液及血清中MMP-13水平相关性

经牙周基础治疗6 周后，慢性牙周炎患者的平均BI与非刺激性全唾液及龈沟液中MMP-13水平相关，并较治疗前平均BI明显改善(P<0.05)(表 3)。慢性牙周炎患者治疗前及治疗后的平均PD与龈沟液中MMP-13水平相关(P<0.05)(表 3)。

3 讨 论

胶原蛋白是牙龈和牙周膜的主要细胞外基质成分，在活动性牙周炎期间，MMP-13通过自身蛋白质水解或其他MMP的催化等方式活化后发挥其降解胶原蛋白的能力，导致牙周组织有机基质的破坏。牙龈结合上皮通过内部基底层中的半桥粒粘附于牙齿，半桥粒由层粘连蛋白-5和整合素α6β4组成，有研究表明，MMP-13能够降解牙龈基底膜中的层粘连蛋白-5的γ2链，加速牙周袋的形成[6-7]。并且MMP-13与组织蛋白酶K和MMP-9协同降解骨基质中的I型胶原蛋白而加速牙槽骨的吸收。

龈上洁治、龈下刮治和根面平整能有效的去除附着在牙面和根面的牙石和菌斑以及肉芽组织，在获得良好的菌斑控制后，绝大多数患者的临床状况都会改善。本研究结果也表明：牙周基础治疗后，除了CAL外，牙周炎患者的BI、PD水平都有显著降低(P<0.05)。且在本研究中，慢性牙周炎患者经牙周基础治疗后除非刺激性唾液外，龈沟液、血清中MMP-13水平均较治疗前显著降低(P<0.05)，但在血清中MMP-13表达水平较低。对慢性牙周炎患者治疗前、后非刺激性唾液、龈沟液以及血清中 MMP-13 含量与牙周临床指标的相关性分析显示：慢性牙周炎患者的BI与PD龈沟液中的MMP-13水平呈正相关，且BI与慢性牙周炎患者的非刺激性唾液呈正相关。提示龈沟液水平更能全面评估牙周炎的预后。Pawar等[8]通过ELASA检测证实通过牙周基础治疗后龈沟液中MMP-13显著降低。许多学者通过对慢性牙周炎患者的GCF分析得出相同的结论：MMP-13在牙周炎患者龈沟液中高表达，可以独立作为牙周炎的诊断分子,且与牙周炎患者非活动性位点以及健康人相比较，牙周炎患者活性位点具有更高水平的MMP-13活性[9-11]。

表 3 患者MMP-13水平与临床指标之间的相关性(n=20)

Tab 3 Correlation of clinical parameters with MMP-13 levels in the patients(n=20)

项 目非刺激性全唾液中MMP-13水平龈沟液中MMP-13水平血清中MMP-13水平治疗前组治疗后组治疗前组治疗后组治疗前组治疗后组r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值BI-0.040.490.370.030.120.680.420.02-0.040.60-0.050.38PD(mm)-0.140.61-0.310.240.690.0040.650.04-0.140.590.190.49CAL(mm)-0.010.910.080.76-0.220.43-0.340.780.040.870.120.91

本实验研究结果表明：慢性牙周炎患者唾液中MMP-13水平治疗后比治疗前的低，但是差异不大，无统计学意义(P>0.05)。 Özcan等[12]所做出来的结论与本研究一致。Virtanen等[13]通过对牙周炎患者与牙周健康的人的唾液中MMP-13水平分析得出健康人唾液中MMP-13比牙周炎患者水平高的结果，本研究结果与其不一致。分析其原因可能是：MMP-13最初在人乳腺癌中发现，其在治疗后的高表达可能与女性性激素水平有关。Collazos等[14]在体外研究中，用IL-1β刺激牙龈成纤维细胞产生MMP-13，孕激素似乎能降低MMP-13的表达水平。在小鼠皮肤的鳞状细胞癌中，雌激素对MMP-13抑制剂的治疗有明显的调节作用，年龄较大的雌性小鼠具有较高水平的MMP-13[15]。除此之外，Yang 等[16]在结扎小鼠牙齿颈部致小鼠患牙周炎的实验性牙周炎的模型试验中发现，MMP-13在牙周炎发展的不同时期有不同的含量变化。尽管牙周基础治疗后牙周炎的临床参数有所改善，但亚急性炎症过程仍可继续，与治疗前相比高MMP-13水平很可能是由于亚临床水平的持续破坏。

本实验研究了MMP-13与牙周炎的关系。检测MMP-13在龈沟液中表达水平有助于牙周炎的诊断以及预后的评估。许多疾病都可以在唾液中找到相关的蛋白分子标记物。同时，唾液的取样还具有无创、便捷等优点，因此MMP-13在唾液中的表达水平变化值得进一步考虑。