蛭龙活血通瘀胶囊对PD大鼠凋亡相关蛋白的影响

王蔚 沈宏萍 杨思进 杜渊

【摘要】目的 观察蛭龙活血通瘀胶囊对帕金森（PD）大鼠凋亡相关蛋白的影响。方法 将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊（ZL）高、中、低剂量组，采用颈背部皮下注射鱼藤酮2 mg/kg/d连续4周以制备PD大鼠模型，观察行为学改变，用免疫组化法检测Bax、caspase-3蛋白表达。结果 蛭龙活血通瘀各药物组大鼠行为学改变较模型组减轻;Bax、caspase-3蛋白表达均有不同程度降低，其中高剂量组最为明显，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 蛭龙活血通瘀胶囊可能通过降低PD大鼠Bax、caspase-3蛋白表达起到治疗帕金森病的作用。

【关键词】蛭龙活血通瘀胶囊;PD;Bax;caspase-3

【中图分类号】R749.2 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.9..02

帕金森病（ParkinsonS disease，PD）又被称为“震颤麻痹”（Paralysis Agitans）[1]。神经细胞凋亡被证实为该病的主要病理表现，本研究通过观察专科院内制剂蛭龙活血通瘀胶囊对PD大鼠脑组织凋亡相关蛋白Bax、caspase-3的表达，探寻该药治疗帕金森病的作用机制。

1 材料与方法

1.1  动物及分组

清洁级健康雄性SD大鼠50只，体重180±20 g，购于成都达硕生物有限公司，普通饲料喂养，室温22±2℃，湿度30～40%，自由摄食、饮水。按随机数字表法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀低剂量组（ZL低剂量组）、蛭龙活血通瘀中剂量组（ZL中剂量组）、蛭龙活血通瘀高剂量组（ZL高剂量组），每组10只。

1.2  造模及给药

模型组每日颈背部皮下注射鱼藤酮溶液（溶解于二甲基亚砜、聚乙二醇-300）2 mg/kg/d，共4周[2];假手术组仅注射二甲基亚砜及聚乙二醇-300混合溶液;ZL低、中、高剂量组分别于注射鱼藤酮溶液后1周灌胃蛭龙活血通瘀胶囊（溶解于3 mL生理盐水）0.3 g/kg/d、0.6 g/kg/d、1.2 g/kg/d;假手术组及模型组同步每日灌胃等体积的生理盐水。

1.3  行为学观察

大鼠给药4周后观察行为学改变 [3]。是否拘捕行为减弱;是否毛色变脏变黄、弓背，主动活动减少;是否动作迟缓、震颤或步态不稳;是否出现单侧旋转;是否瘫痪，行走或进食困难;是否死亡等。

1.4  Bax、caspase-3蛋白表达

大鼠深度麻醉，经过0.9%生理盐水、4%多聚甲醛经心脏灌注后，剥取脑组织浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后再经二甲苯、梯度乙醇、蒸馏水脱蜡，热修复后封闭，一抗及二抗孵育，漂洗后显色，苏木素复染，稀盐酸分化，碳酸锂反蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用光学显微镜观察中脑黑质区相应蛋白的表达（×200），Image-Pro Plus图像分析软件计算Bax、caspase-3阳性细胞数作定量分析。

1.4  统计学方法

实验数据由SPSS 13.0统计软件分析，用均数±标准差（x±s）表示。采用采用方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比较，以P<0.01认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1  各组行为学比较

模型组给药1周左右出现活动减少，进食减少，毛色光泽度下降，发黄变脏，继续给药后出现动作迟缓，姿势呈弓背状，继而出现头部震颤，身体偏向一侧，行走不稳，向单侧转圈;假手术组无上述行为学改变;ZL各药物组较模型组行为学改变程度减轻，高剂量组最为明显。

2.2  各組Bax、Caspase-3表达

ZL各药物组与模型组比较，均有不同程度降低，差异有统计学意义（P<0.05）;ZL高剂量组与低、中剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨 论

PD在中医学中属“颤证”范畴。中医典籍《皇帝内经》中载有“诸风掉眩”、“行则振掉”、“掉振鼓栗”等，提出本病主要临床表现为肢体摇动[4]。PD病因病机较为复杂，临证多以滋补肝肾、补肾活血、益气养血、熄风止颤、养肝柔筋为治法遣方用药[5]。蛭龙活血通瘀胶囊具有益气活血、祛风通络功效，临床治疗帕金森病具有良好疗效[6]。现代医学研究证实细胞凋亡在PD病的发病机制中起重要作用[7]。Caspase-3在中脑黑质神经元的缺失是PD的主要病理特点[8]。细胞在受到凋亡刺激信号后趋向于凋亡，bax蛋白呈高表达，进而调节caspase-3活化，导致神经元损伤增加细胞凋亡[9]。文献报道[10、11]，鱼藤酮具有较强亲脂性可通过血脑屏障，选择性抑制线粒体复合物Ⅰ的活性，引起氧化应激和细胞凋亡，其诱导的PD模型能够重现行为学改变及病理学特征，接近人类PD疾病表现，因此本课题采用鱼藤酮进行PD大鼠模型制备，观察凋亡相关蛋白表达情况。本实验研究表明，蛭龙活血通瘀胶囊能够改善PD大鼠的行为学表现，减少凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3在中脑黑质区域的表达，由此可见，蛭龙活血通瘀胶囊可能通过降低凋亡相关蛋白在脑内的表达从而发挥治疗帕金森病的作用。

参考文献

[1] 中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组.中国帕金森病治疗指南（第三版）[J].中华神经科杂志.2014.47（6）：428.

[2] 姜   新.虫草素对鱼藤酮诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其抗凋亡机制研究[D].扬州大学，2017.

[3] 侯晓丽.人参皂苷-Rg3对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元保护作用机制研究[D].扬州大学，2012.

[4] 吴勉华，王新月.中医内科学[M].第3版.北京：中国中医药出版社，2012：441-446.

[5] 李   哲，胡瀛宇.等.帕金森病中医治疗进展[J].中医药现代化.2014.16（4）：909.

[6] 王   蔚，沈宏萍，杨思进，杜   渊.蛭龙活血通瘀胶囊治疗帕金森病临床疗效观察[J].光明中医.2019，34（18）：2803-2805.

[7] Ferro M M，Bellissimo M L，Anselmo-Franci J A，et al.Comparison of bilaterally 6-OHDA and MPTP-lesioned rats as models of the early phase of Parkinsons disease：histological，neurochemical，motor and memory alteratins[J].J Neurosci Methods.2005，148（1）：78.

[8] 吴建军，肖   清，刘   凯，等.细胞凋亡学说在帕金森病发病机制的理论探索[J].中国老年学杂志.2009，29：2135.

[9] Cregan S P，Maclautin J G，Craig C G，et al.Bax-dependentcaspase-3 activiation is a key determinant in p53-induced apoptosisin neurons [J].J Neurosci，1999，19（18）：7860-7869.

[10] Hollingworth R M，Ahammadsahib K I，Gadelhak G，et al.New inhibitors of complex Ⅰ of the mitochondrial electron transport chain with activity as pesticides[J].Biochem Soc Trans.1994，22（1）：230-233.

[11] Li N，Ragheb K，Lawler G，et al.Mitochondrial complex Ⅰ inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production[J].J Biol Chem.2003，278（10）：8516-8525.

基金項目：西南医科大学校级科研项目，2014QN-039

通讯作者：杜 渊，邮箱：345569502@qq.com