miR-506-3p通过靶向MTDH增加前列腺癌细胞的化学敏感性

侯 赞1，王雪桃，何 朗1，薛志红1，曾贵林1，戴刚毅1，孟又胜1，李光俊，柏 森

(1.成都市第五人民医院肿瘤科,四川 成都 611130；2.四川大学华西医院放疗中心,四川 成都 610041)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界范围内广泛存在的恶性肿瘤之一，主要危害男性泌尿生殖系统，具有较高的致死率[1-2]。近几年来我国前列腺癌的发病率也逐渐上升[3]。目前对前列腺癌采用的治疗手段有手术切除、化疗、放疗等，但预后会出现复发率高、癌细胞易发生转移等问题[4]。加之前列腺癌细胞对化疗药物已经表现出极严重的耐药效应，化疗效果有所降低[5]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)属于紫杉烷类，是化疗常用药物。正常情况下紫杉醇相对于其他药物表现出2～3个月的中位生存优势，能明显改善患者生活质量，但患者在后期出现耐药性后仍然会死于前列腺癌[6-7]。因此，阐明前列腺癌细胞耐药机制，提高其对紫杉醇的化学敏感性，是治疗前列腺癌亟需解决的难点问题。

microRNA(miRNA)是一类长度只有18～24 bp的非编码RNA，在真核细胞中广泛存在，能结合到下游mRNA的非编码区并调控其表达，进而参与多项生命过程[8]。研究发现，多种肿瘤的发生及发展过程都有miRNA的参与，这与其表达模式有密切关联[9]。miR-506-3p位于X染色体上，是miR-506-514族成员之一，有众多靶基因[10]，已发现其在直肠癌[11]、黑色素瘤[12]、视网膜母细胞瘤[13]等恶性肿瘤中发挥调控作用。有研究报道miR-506-3p在前列腺癌细胞中低表达[14]，但尚无miR-506-3p参与前列腺癌细胞化学敏感性调控的相关报道。异黏蛋白(metadherin，MTDH)也称星型胶质细胞上调基因-1(AEG-1)，是一类原癌基因，在多种恶性肿瘤中高表达[15-17]。在前列腺癌中过表达MTDH可促进前列腺癌细胞存活、侵袭和迁移，并抑制其凋亡[18-19]。本研究将探索过表达miR-506-3p对前列腺癌细胞生长和凋亡的影响，前列腺癌细胞中miR-506-3p与MTDH之间的靶向关系，进一步揭示miR-506-3p与MTDH相互作用对前列腺癌细胞化学敏感性的影响，以期改善前列腺癌的预后效果。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器

前列腺癌细胞系(PC-3、DU145、LNCaP)、正常前列腺细胞系(RWPE-1)购自中科院上海生命科学院细胞库，Trizol reagent总RNA提取试剂盒(Sigma)，反转录试剂盒、RT-qPCR定量试剂盒(Takara)，miR-506-3p mimic、NC mimic(锐博)，胎牛血清(Hyclone)，DMEM培养基(Gibco)，MTDH、Bcl-2、Bax、GADPH抗体(CST)，紫杉醇(Sigma)，引物设计(上海生工)，Hoechst染色试剂盒(碧云天)，LV-MTDH(吉凯)，ECL化学发光检测试剂盒(ThermoFisher)，Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen)，双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega)，定量PCR仪(Corbett)光显微镜(蔡司)，多功能酶标仪(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 组织获取 从我院行前列腺癌切除术的患者中获取癌组织。所有志愿者均签署了有关临床数据的书面知情同意书。本研究得到我院研究伦理委员会和临床医学学院的批准，并根据《赫尔辛基宣言》的道德准则进行。

1.2.2 细胞培养 将PC-3、DU145、LNCaP、RWPE-1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置于37 ℃、含5% CO2的恒温培养箱内。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-506-3p和MTDH的表达水平 取对数期的细胞，用Trizol reagent总RNA提取试剂盒提取出细胞内的总RNA，将miRNA和mRNA分别反转录为cDNA，再进行定量分析。RT-qPCR条件：95 ℃持续10 min，然后再95 ℃持续15 s，60 ℃持续25 s，72 ℃持续35 s，进行40个循环。用U6标准化，使用2-ΔΔC法测量表达水平。miR-506-3p的正向引物：5′-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3′,反向引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；MTDH的正向引物：5′-TTACCACCGAGCAACTTACAAC-3′,反向引物：5′-ATTCCAGCCTCCTCCATTGAC-3′；U6的正向引物：5′-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3′,反向引物：5′-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTGTC-3′。

1.2.4 构建人前列腺癌耐药细胞株PC-3/PTX 取对数期的PC-3细胞，以化疗常用药物紫杉醇为诱导药物，采用间歇逐步增加计量法[5]诱导PC-3细胞产生耐药性，最终PC-3/PTX细胞维持在1 μg/mL紫杉醇以保持耐药性。

1.2.5 分组及处理 取PC-3/PTX细胞用胰蛋白酶消化后，将适量细胞接种于24孔板，随机分为5组：对照组、NC mimic组、miR-506-3p mimic组、LV-MTDH组、mimic+MTDH组。培养24 h后使用Lipofectamine 3000转染试剂盒分组进行转染。

1.2.6 CCK8检测PC-3/PTX细胞活力 CCK8分析检测PC-3/PTX细胞存活率，并计算细胞IC50值。将1.2.5分组处理细胞在培养箱中预培养24 h，向培养板中加入不同浓度的紫杉醇(0、2、4、6、8、10 μg/mL)，并设置不加细胞液的对照孔，每种处理设3个复孔。孵育24 h后，向每孔加入10% CCK8无血清培养液200 μL，孵育4 h后于酶标仪上测定450 nm处的吸光值(A)。细胞存活率(%)=[A(加药)-A(对照)]/[A(0加药)-A(对照)]×100%。以药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制浓度-效应曲线，确定板书抑制浓度(IC50)。

1.2.7 克隆形成分析检测细胞的生长情况 将消化后的细胞以500个/孔接种于6孔板，培养14 d后去培养液并用PBS洗涤，3.7%甲醛固定10 min，用结晶紫染色后于显微镜下观察并统计克隆形成情况。

1.2.8 Hoechst检测细胞的调亡情况 取转染成功后的PC-3/PTX细胞平铺于6孔板，每孔分别加入1 mL Hoechst染色液，继续培养20～30 min，弃染色液并进行荧光检测，将其置于倒置荧光显微镜下观察各组细胞核呈蓝色的细胞，观察并记录凋亡细胞数目，并计算细胞凋亡率。

1.2.9 Western blot检测调亡相关蛋白Bcl-2、Bax和MTDH的表达 收集转染成功的细胞，用PIPA裂解液提取总蛋白，并用BCA试剂盒检测浓度，将蛋白于10% SDS-PAGE进行电泳分离，用半转模仪转移蛋白质至PVDF膜，在5%脱脂牛奶封闭液中封闭90 min，加入一抗4 ℃过夜孵育，漂洗后加入二抗室温孵育1 h，再次漂洗后用ECL液显色曝光，用GAPDH作为内标蛋白，使用Image J软件处理图像并计算蛋白相对表达水平。

1.2.10 双荧光素酶报告基因实验验证miR-506-3p和MTDH之间的靶向关系 先用TargetScan软件预测miR-506-3p与MTDH的潜在结合位点。从PC-3/PTX细胞中扩增出包含结合位点的片段以及包含突变结合位点的片段，将其分别连接到报告基因载体上，命名为MTDH野生型(WT)和突变型(MUT)重组质粒。之后又将其分别与NC mimic或miR-506-3p mimic共转入PC-3/PTX细胞，再按试剂盒使用说明测定各组荧光素酶活性变化。

1.3 统计学方法

使用SPSS 19.0软件进行数据分析，利用GraphPad Prism绘制图表，多组间比较用单因素方差分析，2组比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异具有极显著性统计学意义。

2 结果

2.1 miR-506-3p与MTDH在前列腺癌细胞中的表达模式

RT-qPCR定量结果显示，miR-506-3p在前列腺癌组织及细胞系(PC-3、DU145、LNCaP)中的表达水平显著低于在正常前列腺组织及细胞系(RWPE-1)中的表达水平；而MTDH却表现出与miR-506-3p表达模式相反的趋势，在前列腺癌组织及细胞中表达水平高于在正常前列腺组织及细胞系(RWPE-1)中的表达水平，且以前列腺癌细胞系PC-3差异最大(图1)。表明在前列腺癌组织及细胞中，miR-506-3p低表达，而MTDH高表达。

2.2 miR-506-3p过表达抑制前列腺癌耐药细胞PC-3/PTX生长

miR-506-3p在人前列腺癌耐药细胞株PC-3/PTX的表达量显著低于在前列腺癌细胞PC-3的表达量(图2a)，说明miR-506-3p的表达降低可能是前列腺癌细胞对紫杉醇产生耐药的原因。经miR-506-3p mimic和NC mimic分别转染PC-3/PTX细胞后，miR-506-3p mimic组的PC-3/PTX细胞内miR-506-3p的表达水平显著高于对照组和NC mimic组，说明处理成功(图2b)。随着紫杉醇浓度的增加，3组处理的PC-3/PTX细胞存活率均逐渐下降；当紫杉醇浓度达10 μg/mL时，miR-506-3p mimic组的PC-3/PTX细胞存活率、IC50值以及克隆细胞数目明显低于对照组和NC mimic组(图2c～e)，说明miR-506-3p过表达会抑制PC-3/PTX细胞生长，增加其化学敏感性。

*：与RWPE-1比较，P<0.05；#：与RWPE-1比较，P<0.01;△：与癌旁组织比较，P<0.01 a:前列腺癌组织及正常组织中miR-506-3p及MTDH的表达水平； b:前列腺癌细胞系中miR-506-3p的表达水平；c：前列腺癌细胞系中MTDH的表达水平

图1 RT-qPCR检测miR-506-3p与MTDH在前列腺癌细胞中的表达

2.3 miR-506-3p过表达促进前列腺癌耐药细胞PC-3/PTX凋亡

与对照组和NC mimic组相比，miR-506-3p mimic处理后的PC-3/PTX细胞凋亡率显著升高，增长幅度为2倍以上(图3a)，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，促凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高(图3b)，表明miR-506-3p过表达会促进PC-3/PTX细胞凋亡，从而增加其化学敏感性。

2.4 miR-506-3p靶向抑制MTDH的表达

用TargetScan软件预测，发现在MTDH 3′UTR的978-985 bp区域存在has-miR-506-3p的潜在结合位点(图4a)。用双荧光素酶报告基因实验验证，MTDH野生型较突变型能使荧光素酶活性显著下降(图4b)，说明miR-506-3p与MTDH之间确实存在靶向关系。Western blot检测发现miR-506-3p mimic组PC-3/PTX细胞中MTDH蛋白表达水平显著低于对照组和NC mimic组(图4c)，表明过表达miR-506-3p会抑制MTDH的表达，即miR-506-3p靶向抑制MTDH的表达。

*：与对照组比较，P<0.05;#：与对照组比较，P<0.01;△：与PC-3比较，P<0.01 a：RT-qPCR检测在前列腺癌耐药细胞株PC-3/PTX中miR-506-3p的表达水平；b：RT-qPCR检测在转染处理的前列腺癌耐药细胞株中miR-506-3p的表达水平;c：CCK8检测细胞活力； d：CCK8检测细胞IC50；e：克隆形成实验检测细胞的生长(结晶紫染色×200)

图2 miR-506-3p过表达抑制前列腺癌耐药细胞PC-3/PTX生长

*：与对照组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.01 a：Hoechst检测细胞的调亡情况(×400)；b：Western blot检测调亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达

图3 miR-506-3p过表达促进前列腺癌耐药细胞PC-3/PTX凋亡

2.5 miR-506-3p通过靶向抑制MTDH的表达增强PC-3/PTX细胞的化学敏感性

引入慢病毒载体LV构建过表达MTDH，将LV-MTDH转染至PC-3/PTX细胞后发现，MTDH的表达水平较对照组和LV-MTDH组明显升高(图5a)，说明载体构建和细胞转染是成功的。将miR-506-3p mimic、LV-MTDH单独或联合转染PC-3/PTX细胞，检测其MTDH的表达水平、克隆数目及凋亡情况的变化。相比于对照组，miR-506-3p mimic组中MTDH的表达量显著下降，PC-3/PTX细胞克隆数目减少，凋亡率升高，而LV-MTDH组中MTDH的表达量明显升高，PC-3/PTX细胞克隆数目增加，凋亡率显著下降。相对于LV-MTDH组，mimic+MTDH组PC-3/PTX细胞中MTDH的表达量显著下降，细胞克隆数目减少，凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5b～d。上述结果表明，MTDH过表达会促进PC-3/PTX细胞生长、抑制其凋亡，并且miR-506-3p过表达可逆转MTDH过表达对PC-3/PTX细胞产生的影响，因此，miR-506-3p能够通过靶向抑制MTDH的表达增强PC-3/PTX细胞的化学敏感性。

*：与NC mimic组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.01 a：TargetScan软件预测靶向关系；b：双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系；c：Western blot检测调亡相关蛋白MTDH的表达

图4 miR-506-3p靶向抑制MTDH的表达

*：与对照组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.01；△：与LV-MTDH组比较，P<0.05；▲：与LV-MTDH组比较，P<0.01a、b：Western blot检测调亡相关蛋白MTDH的表达；c：克隆形成实验检测细胞的生长(结晶紫染色×200)；d：Hoechst检测细胞的调亡情况(×400)

图5 miR-506-3p通过靶向抑制MTDH的表达增强PC-3/PTX细胞的化学敏感性

3 讨论

对于前列腺癌的治疗目前主要采用常规临床手段，虽然可以暂时缓解癌症症状，但治疗后1～3年内易出现复发，对化疗药物产生耐药，最终导致前列腺癌进入晚期，大幅降低患者的存活率[20]。紫杉醇是一类临床治疗癌症的常规化疗药物，前列腺癌患者用药一段时间后会出现耐药，严重破坏治疗效果[6]。因此，阐明其耐药机制对患者预后具有重要意义。关于miR-506-3p和MTDH的关系及其对癌细胞化学敏感性的影响，目前还未见相关的报道。本研究探索了miR-506-3p和MTDH在前列腺癌细胞和正常前列腺细胞中的表达情况，通过检测miR-506-3p过表达对人前列腺癌耐药细胞株PC-3/PTX生长、凋亡的影响，体外验证miR-506-3p与MTDH的靶向关系，并验证其相互作用对PC-3/PTX细胞的影响。

本研究中，miR-506-3p在前列腺癌细胞中低表达，表明在前列腺癌中miR-506-3p是一个抑癌因子，与之前的报道一致[14]。miR-506-3p在其他疾病中也有着相似的作用，能抑制人肝癌细胞的侵袭和转移[21]；过表达miRNA-506和miRNA-124可减轻人心肌细胞功能障碍[22]；miR-506-3p能抑制骨肉瘤细胞自噬、侵袭和转移[10,23]，还可抑制鼻咽癌肿瘤生长和转移[24]；沉默miRNA-506可促进非小细胞肺癌的发展[25]。而MTDH在前列腺癌细胞中高表达，与前人研究一致[15,19]，表明其在前列腺癌中也是一个促癌因子，若降低MTDH的表达可抑制食管癌细胞增殖，抑制胶质瘤细胞、胃癌细胞增殖、侵袭和迁移[17，26-27]。据相关数据显示，我国大约70%的前列腺癌患者为局部晚期或已发生广泛转移[28]，那么或许可将miR-506-3p或MTDH在前列腺癌细胞的表达情况作为前列腺癌恶性程度的早期确诊指标。miR-506-3p在耐药细胞PC-3/PTX中的表达水平明显低于正常前列腺细胞，表明前列腺癌细胞产生耐药性可能是内部miR-506-3p的表达量降低导致的。并且miR-506-3p过表达可明显抑制PC-3/PTX细胞的生长，促进其凋亡，即miR-506-3p过表达可以增加前列腺癌细胞对紫杉醇的化学敏感性。有报道称，miR-34a过表达可增强前列腺癌细胞对紫杉醇的耐药性，在这方面miR-506-3p与miR-34a可能存在协同作用[29]，但还需进一步研究。

另外，本研究观察到miR-506-3p与MTDH的表达模式在前列腺癌细胞中呈负相关，随后通过双荧光素酶报告基因实验以及检测过表达miR-506-3p的PC-3/PTX细胞中MTDH蛋白表达水平变化来证明miR-506-3p与MTDH之间确实存在着靶向抑制的关系。之前有报道称，MTDH上游有一些miRNA靶向调控[19,27]，但未见miR-506-3p的相关研究，因此本研究结果可以说是前列腺癌中的一项重大发现。进一步研究两者的这种靶向关系发现，miR-506-3p通过靶向抑制MTDH的表达抑制PC-3/PTX细胞生长，促使其发生凋亡，可以增强前列腺癌细胞的化学敏感性。

综上所述，本研究证明了miR-506p和MTDH参与调控前列腺癌细胞的化学敏感性，并且初步揭示了其调控机制可能是miR-506-3p靶向抑制MTDH的表达来抑制前列腺癌耐药细胞生长，促使其发生凋亡。本研究结果将为解决前列腺癌细胞耐药性这一重大难题提供一个新的思路，即通过调节癌细胞内miR-506-3p与MTDH的表达水平，或者干扰二者之间的靶向关系影响细胞耐药性。但本实验仅为体外细胞实验，关于其在动物体内的实验还需进一步研究。