舌鳞状细胞癌中HuR与端粒酶活性之间关系的研究

段阳芳 程晓雷 王玲 张强 危由春

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma. TSCC)是最常见的口腔颌面部肿瘤之一，侵袭力强，复发率高，虽然临床上的诊断和治疗手段不断提高，但是病人的五年生存率仍旧很低[1-2]。因此探究背后的发病机制具有很高的临床应用价值。端粒是真核细胞染色体线性末端特殊的结构，由端粒DNA和端粒相关蛋白组成，保护染色体末端结构的完整性，防止染色体末端被DNA损伤识别系统(DNA damage respond, DDR)识别而发生融合或重组[3]。端粒酶在维持端粒长度中起着十分关键的作用，端粒酶由端粒酶RNA成分TERC和端粒酶催化亚基TERT以及端粒酶相关蛋白组成。大量研究表明，在不同类型的肿瘤细胞中，端粒酶活性都异常高于正常细胞，敲低TERT或者TERC以及其他影响端粒酶活性的机制都有可能导致肿瘤细胞的增殖减慢，证明了端粒酶活性在维持肿瘤细胞过程的重要性[4-7]。RNA结合蛋白HuR是胚胎致死性视网膜异常(embryonic lethal abnormal vision, ELAV)家族中的重要成员，其广泛表达于各种组织中，通过结合到RNA上，参与基因的转录后调控，包括调控RNA的剪切，加工，稳定和翻译等，进而调控细胞生长，炎症反应，细胞衰老等生命过程。大部分的肿瘤细胞中HuR表现为异常高表达，通过调控不同的靶基因，从而影响肿瘤细胞的增殖，侵袭和耐药性等。本文拟探究舌鳞癌细胞中端粒酶活性和HuR的表达水平以及之间的关系，并探索舌鳞癌发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验对象 临床手术癌及正常组织样本(6 例)(南昌大学第一附属医院)；舌鳞癌细胞系SCC-25(ATCC。

1.1.2 主要试剂与仪器 丙烯酰胺胶(B1000)、 RIPA裂解液(C1053)(北京普利莱)； 蛋白酶抑制剂(L2500,Selleck,美国)； TRAP试剂盒(KGA414,南京凯基)； HuR抗体、 Tubulin抗体、 GAPDH抗体(11910-1-AP, 11224-1-AP,6004-1-Ig,Proteintech, 美国)； Flag抗体(F1804, Sigma, 美国)； 荧光二抗(A23910,A23920, 武汉亚科因)；PierceTM-Magnetic-RNA-Protein-Pull-Down-Kit(20164, Thermo, 美国)； Protein A/G(B23201, 上海biomake); TransZol、 反转录试剂盒(ET101-01)、 TransStart Top Green qPCR SuperMix(AQ101, 北京全式金生物)；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668030)、PCR仪(Thermo, 美国)；TaKaRa-genomic-extraction-Kit(9781S,TaKaRa, 日本)；Telo-TAGGG-telomere-Length-Assay(1220913600,Roch,美国)；Odyssey CLx双色红外激光成像系统(LICOR,美国)荧光定量PCR仪器CFX96(BioRad,美国)。

1.2 方法

1.2.1 组织和细胞端粒酶活性检测 组织样本端粒酶提取：手术后取下的组织，立即保存在液氮之中。 40～100 mg冷冻的组织用无菌眼科剪尽量剪碎，用研磨器研磨，加入40 μl的NP-40 lysis buffer(10 mmol/L Tris pH8.0, 1 mmol/L Mgcl2, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl 1% NP40) (加入β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂)，涡旋振荡10 s, 置于冰上30 min，4 ℃，12 000 r/min, 20 min移取上清液，分装速冻至液氮备用，其中一份用来定量，并调整到同一浓度。

细胞样本端粒酶提取：收集细胞，对细胞进行计数，取10 万个细胞放入离心管中，3 000 r/min, 5 min，弃上清，加入50 μl NP-40 lysis buffer,至冰上置于冰上30 min，4 ℃，12 000 r/min, 20 min移取上清液，分装速冻至液氮备用。

端粒重复序列扩增法(TRAP):每个样品取2 μl加入48 μl的TRAP反应体系中，混匀，在PCR仪上进行如下反应，30 ℃，孵育30 min，94 ℃，5 min，之后进行25 个以下循环，94 ℃，30 s； 50 ℃，30 s； 72 ℃，30 s，最后72 ℃延伸5 min。反应产物取20 μl跑胶，用SYBR-Safe对凝胶进行染色，紫外灯下检测。

1.2.2 蛋白免疫印迹(Western blot) 组织或细胞样品，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清用BCA方法进行蛋白定量后加入Loading buffer，95 ℃煮10 min。在丙烯酰胺胶中上等量的蛋白量，电泳，转膜，4 ℃孵育一抗，HuR(1∶1 000)，Tubulin(1∶5 000),GAPDH(1∶5 000),Flag(1∶1 000)，用TBST洗膜，洗3 次每次10 min，之后在室温孵育相应的荧光二抗，1 h，用TBST洗膜，洗3 次每次10 min, 发光。

1.2.3 RNA-pulldown 实验方法参照厂家说明书。简要地说，用引物5′-CCAAGCTTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCT-3′和5′-GCTGTGTGAGCCGAGTCCTGG-3′对PCR扩增带有T7启动子的TERC作为标记探针的模板，0.5 mg的标记探针和250 μg的RIPA裂解细胞液室温孵育30 min后，RNA-蛋白复合体用paramagnetic-streptavidin-conjugated-Dynabeads沉淀后Western blot检测。

1.2.4 RNA免疫共沉淀实验(RNA-IP) 细胞在紫外线(200 mJ/cm2)交联后用IP buffer(50 mmol/L HEPES pH7.5, 150 mmol/L KCl, 2 mmol/L EDTA,1%NP-40)裂解后，500 μg的蛋白裂解液和2 μg的HuR抗体或者lgG抗体孵育，RNA-蛋白复合体用Protein A/G沉淀，IP wash buffer(50 mmol/L HEPES pH7.5, 300 mmol/L KCl, 1 mmol/L DTT, 1% NP-40)洗4 次，每次10 min。 RNP-IP 产物加Trizol 提取后，RT-PCR检测。

1.2.5 逆转录实时荧光定量PCR反应 Trizol法提取的RNA定量后取1 μg进行逆转录反应。参照说明书配置qPCR mix, 引物对5′-TCTAACCCTAACTGAGA

AGGGCGTAG-3′和5′-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3′检测TERC，引物对5′-GGGTGACATCGGGAGAACG-3′和5′-CTGAACAGGCTTCGTAACTCAT-3′检测HuR，引物对5′-CTGGGCTACACTGAGCAC-3′和5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′ 检测内参GAPDH。

1.2.6 细胞培养和转染 SCC25细胞购于中科院细胞中心，用DMEM加10%胎牛血清，双抗，培养于37 ℃，5% CO2细胞培养箱。转染用Lipofectamine2000,按照试剂说明书进行操作，寡核苷酸5-AAGAGGCAATTACCAGTTTCA-3用于敲低HuR。通常情况下，敲低72 h收细胞检测；过表达质粒48 h收细胞检测。

1.2.7 端粒长度检测 用试剂盒提取基因组后按照Telo TAGGG telomere Length Assay说明书进行检测。简要地，基因组首先用HilfI和Rsal限制性内切酶消化，之后用0.8%琼脂糖胶电泳，毛细管虹吸转膜后，预杂交后用地高辛标记探针进行杂交，去掉杂交液后用wash buffer洗膜，室温孵育抗地高辛的带有碱性磷酸酶的二抗，最后，加入发光底物后暗室压片曝光。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，采用独立样本t检验和单因素方差分析(ANOVA)对数据进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 舌鳞癌中端粒酶活性及HuR表达水平增高

收集6 组临床舌鳞癌组织及正常组织中，组织端粒酶活性分析结果显示，癌组织中端粒酶活性明显高于正常组织(P<0.001)(图 1A 左：TRAP； 右：相对的端粒酶活性)。同样地，组织Western Blot 结果表明在癌组织中HuR的表达水平也明显增高，且具有统计学意义(P<0.05)(图 1B 左:Western blot； 右：HuR的相对表达水平)。其中blank空白孔1N-6N为正常组织，1C-6C为癌组织。

图 1 正常组织和癌组织中端粒酶活性及HuR表达水平

Fig 1 The level of telomerase activity and HuR in normal and carcinoma tisssues

2.2 HuR能够和端粒酶RNA TERC 结合

RNA-pulldown结果显示，端粒酶RNA TERC的A片段能够结合HuR(图 2A, P16-CR为阴性对照，P16-3UTR为阳性对照)。同样，RNA免疫沉淀实验显示，相比lgG，HuR能够明显富集TERC(P<0.001)(图 2B, 上: RNA-IP结果；下：鉴定IP的效果)。以上结果表明，HuR能够和端粒酶RNA TERC结合。

图 2 HuR与端粒酶TERC的结合情况

2.3 HuR影响端粒酶的组装

在稳定表达Flag-TERT的舌鳞癌细胞系SCC25细胞中敲低HuR，Western blot 结果显示，Flag-TERT的蛋白水平不受影响(图 3A)，同样qPCR结果显示，TERC的水平也没有改变(图 3B)。然而，在敲低HuR的细胞中，RNA-pulldown实验显示，结合到TERC上的HuR和Flag-TERT明显减少(图 3C)。同时，敲低HuR后，TRAP结果显示，端粒酶活性也明显降低(图 3D)。

图 3 敲低HuR对SCC25细胞端粒酶的影响

以上结果表明，HuR可能是通过影响TERC和Flag-TERT的结合，进而影响端粒酶的活性。

2.4 长期敲低HuR使舌鳞癌细胞端粒缩短

分别收集敲低HuR 3 d，30 d和60 d的SCC25细胞，western blot结果显示敲低效果显著，TRAP检测每个时间点实验组的端粒酶活性均降低(图 4A)。细胞提取基因组后用Southern Blot 检测其端粒长度，结果显示，与对照细胞相比，实验组端粒明显缩短，且具有时间依赖性(图4B)。

图 4 敲低HuR对SCC25细胞端粒长度的影响

Fig 4 The effect of HuR knockdown on telomere length in SCC25 cells

3 讨 论

端粒酶是一个复杂的RNA核糖核蛋白体，其核心成分由端粒酶RNA TERC,端粒酶催化亚基TERT和DKC1组成。端粒酶在细胞核内卡哈尔体(cajal body)中组装成熟，并转移到端粒末端，在端粒相关蛋白的帮助下打开端粒并进行延伸反应[8]。其中任何一个环节对于端粒的延伸都至关重要。正常体细胞端粒酶活性极低，端粒长度随分裂逐渐缩短，干细胞，精细胞和约85%的肿瘤细胞中均可检测出很高的端粒酶活性[9]，这就为肿瘤的诊断和治疗手段提供了新的靶点。

研究表明，正常的口腔黏膜组织中端粒酶活性很低，而癌前病变，癌组织中端粒酶活性明显增高，且活性高低与肿瘤的分化程度和肿瘤的预后呈负相关[10-12]，因此端粒酶活性可以作为区分口腔恶性肿瘤与良性肿瘤或者正常黏膜组织的标志。大部分肿瘤细胞中存在端粒酶催化亚基TERT启动子区突变导致其异常表达，是肿瘤细胞端粒酶活性增高的机制[13-14]。有研究报道，头颈部鳞状细胞癌中TERT启动子区突变率约为17%，而起源于舌的鳞癌更高[14]。在口腔鳞状细胞癌中，TERT启动区甲基化状态的变化可能是促进TERT水平的表达增高的原因之一[15]。并且，TERT的表达水平高低也和临床疾病的侵袭性密切相关[16]。尽管TERT的异常表达被认为是调控口腔肿瘤发生发展的重要机制之一，但是作为端粒延伸模板的TERC同样不可或缺。近些年多篇文献报道，口腔鳞状细胞癌中TERC水平明显增高，TERC的转录增加与肿瘤的恶性程度呈正相关[17-19]。在口腔癌细胞中RNA结合蛋白脆性X染色体相关蛋白1(FXR1)能够结合到端粒酶TERC上，保护其不被降解，从而避免了P53介导的细胞衰老[20]。以上研究表明端粒酶TERC在口腔肿瘤细胞的发生发展中也起到很重要的作用。

本文从端粒酶TERC入手，发现另一种在口腔肿瘤细胞中高表达的RNA结合蛋白HuR能够结合到TERC上，使其与端粒酶催化亚基TERT的结合增加，促进了端粒酶的成熟，进而从另一方面补充了口腔肿瘤细胞中端粒酶活性的增高的机制。在SCC25细胞中长期敲低HuR，端粒酶活性降低，而端粒长度明显缩短，说明了HuR在OTSC中端粒酶活性调控的重要性。既往研究表明，HuR通过结合到靶基因的3'非翻译区，对其剪切加工，稳定性和翻译效率进行调控。但也有文献报道，HuR能够结合到c-myc基因上从而影响其与microRNA let-7的结合，提示HuR或许能够影响靶基因RNA的结构[21]。因此本研究推测HuR有可能促进TERC结构的折叠从而使得TERT与TERC的结合增强，但是其具体的机制还有待深入探究。