钛种植体表面Ca-antimiR138复合物修饰促进间充质干细胞成骨分化的研究

方开秀 侯亚杰 许晓茹 贾森 魏洪波 宋文

钛种植体表面诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化是其体内骨结合建立的生物学基础[1-2]。种植体表面物理形貌优化是最为经典的方式，也是目前临床上广泛采用的方法，其中利用阳极氧化的方法建立的可控纳米管结构是研究的重要分支之一[3-4]。然而另有一部分研究指出，单纯的形貌因素缺乏主动的骨诱导特性，利用功能性生物分子进行种植体表面功能化，直接参与MSCs的成骨分化过程，势必具有更显著的优势[5]。本研究前期利用RNA干扰(RNA inteference，RNAi)技术对种植体表面功能化进行了系统性探索，发现在不同的加载方式下，siRNA(靶向CKIP-1)或miRNA(antimiR138)均可诱导种植体表面MSCs的成骨分化[6-7]，这提示利用RNAi技术进行种植体表面生物功能化修饰具有较强的可行性。在RNAi技术的研究中，安全、高效、经济的纳米载体是制约其应用的关键环节。天然或人工合成的非病毒载体可在一定程度上实现高效、安全的细胞转染，然而存在成本过高、潜在毒性等不足，我们前期的研究发现单纯应用钙离子即可在MSCs中实现高效的RNAi过程[7]，这提示应用钙离子进行种植体表面RNAi功能化修饰具有极佳的应用前景。本研究观察了钙离子转运siRNA的特点，并将Ca-antimiR138复合物吸附于钛种植体表面，证实了其诱导MSCs成骨分化的能力。

1 材料与方法

1.1 主要材料和设备

靶向GFP的siRNA(siGFP)、阴性对照siRNA(siNC)、Cy3荧光标记siGFP(siCy3)、antimiR138以及脂质体2000(lipof)(上海吉玛公司)； 氯化钙、氢氟酸、PBS、DMSO(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)； Opti-MEM、胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶(Gibco，California，USA)；MTT、4%多聚甲醛、BCIP/NBT染色液(北京雷根生物)； 纯钛试样(1 cm边长正方形，西安西北有色金属研究院)； 倒置荧光显微镜(Olympus，Tokyo，日本)； 流式细胞仪(Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA)；酶标仪(FLUOstar，Ortenberg，Germany)；扫描电镜(S-4800 HITACHI，Tokyo，Japan)；激光共聚焦(Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)；体式显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)。

1.2 细胞培养

端粒酶缺失永生化、稳定表达GFP的MSCs细胞由丹麦奥胡斯大学纳米中心赠送，细胞培养在常规培养基中，即在EMEM中加入10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞密度达80%左右时进行胰酶消化传代，细胞按照2×104/cm2密度进行接种。

1.3 细胞常规转染过程

细胞培养24 h后在其中额外加入氯化钙溶液，依据文献报道[8]，使得钙离子浓度区间为0～50 mmol/L，再分别加入不同的siRNA，使得siRNA终浓度为40 nmol/L，同时采用标准的脂质体2000作为阳性对照、未处理细胞作为阴性对照；转染6 h后将培养液换成常规培养基，完成细胞转染。

1.4 流式细胞仪检测

在设定检测点，采用胰酶将细胞消化收集，离心后用PBS清洗，离心、弃上清；采用适量PBS重悬细胞沉淀，进行流式细胞仪检测，分析10 000 个细胞，利用细胞折光性进行圈门，在FL1通道上分析GFP荧光分布状况，在FL2通道上分析Cy3荧光分布状况，同时进行平均荧光强度的定量分析。

1.5 荧光显微镜观察

在设定检测点，吸弃细胞培养液，加入预热的PBS，立即在倒置荧光显微镜下观察，曝光时间设定为100 ms并保持一致，每组随机采集5 张照片。

1.6 细胞活力检测

细胞转染72 h后，吸弃培养液，PBS漂洗，加入MTT工作液，37 ℃孵育4 h；将上清轻轻吸弃，加入DMSO充分溶解紫色结晶，于580 nm出读取吸光度。

1.7 钛种植体表面修饰

采用20 V电压下阳极氧化30 min在钛种植体表面制备亲水纳米管表面，浸泡在Ca-siRNA复合物中6 h后室温干燥，采用扫描电镜和激光共聚焦进行种植体表面观察。

1.8 ALP染色及图像分析

采用Ca-antimiR138进行种植体表面修饰，将MSCs培养在种植体表面并诱导成骨分化7 d后，MSCs在种植体表面诱导分化7 d后，采用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS充分清洗后加入BCIP/NBT染色工作液，覆盖钛试样，室温避光； 30 min后吸弃染色液，加入去离子水终止反应，体式显微镜拍照；采用ImageJ软件对图像蓝紫色深浅进行半定量分析。

2 结 果

2.1 不同钙离子浓度下siRNA的沉默效率及对细胞活力的影响

可见当钙离子浓度超过5 mmol/L之后，siGFP处理组细胞GFP荧光强度显著下降，siNC处理组无显著变化，同时脂质体2000作用下GFP荧光强度也减弱(图 1A)；当超过10 mmol/L之后沉默效率可达90%以上，与脂质体2000效果相当(图 1B)；各组浓度作用下细胞活力未受到显著抑制，而脂质体2000则表现出一定的细胞活力抑制作用(图 1C)。基于此，后期实验以20 mmol/L的钙离子浓度进行。

A：不同浓度钙离子条件下siRNA转染48 h后荧光显微镜观察； B：GFP沉默效率定量； C：不同钙离子作用下细胞活力状况

图 1 不同钙离子浓度下siRNA的沉默效率及对GFP-MSCs细胞活力的影响(×100)

A: The fluorescence microscope images after 48 h siRNA transfection under different calcium concentrations； B: The GFP fluorescence intensity knockdown efficiency quantification； C: Cell viability under different calcium concentrations

Fig 1 The siRNA knockdown efficiency and cell viability under different calcium concentrations in GFP-MSCs(×100)

2.2 细胞摄取siRNA观察

荧光显微镜观察可见明场下每个细胞内均有siCy3的进入，表明细胞摄取率接近100%(图 2A、 2B)；流式细胞仪检测可见在Ca-siRNA转染后，细胞红色荧光分布几乎全部右移(图 2C)，平均荧光强度增强约2 倍(图 2D)。

2.3 血清在Ca-siRNA转染中的作用

在无血清培养基中进行转染，可见细胞在6 h后已经发生破裂，与siCy3的位置分布一致，而在有血清培养基中细胞形态完整，siCy3与细胞轮廓一致(图 3A)；转染48 h后，无血清培养基中细胞破裂死亡，在有血清培养基中细胞表现出GFP沉默效果(图 3B)。

A：明场细胞照片(×100)； B：同一视野下在Cy3通道观察(×100)； C：流式细胞仪进行Cy3荧光分布检测； D：流式细胞仪检测细胞内平均荧光强度

图 2 在20 mmol/L钙离子作用下细胞摄取siRNA(Cy3标记)效率观察

A: Bright field image of cells(×100); B: The Cy3 channel at the identical scope(×100); C: Flow cytometry analysis of Cy3 fluorescence distribution; D: The average intracellular fluorescence intensity measured by flow cytometry

Fig 2 The siRNA (Cy3 labeled) uptake observation under 20 mmol/L calcium treatment

2.4 种植体表面Ca-siRNA加载观察

经过阳极氧化后纯钛表面形成规则的纳米管结构，管径约100 nm，进行Ca-siRNA吸附后表面呈现大量高密度复合物(图 4A)；采用siCy3进行加载，激光共聚焦观察并3D重建，可见红色荧光分布较为均一(图 4B)。

2.5 种植体表面修饰后诱导MSCs成骨分化检测

采用Ca-antimiR138进行种植体表面修饰，MSCs在其表面诱导分化7 d后可见ALP活性显著增强(图 5A)，半定量分析可见修饰后种植体表面ALP活性增强可达10 倍以上(图 5B)。

A：Ca-siRNA分别在无血清和有血清培养基中转染细胞，6 h后进行摄取观察； B：48 h后观察细胞GFP荧光强度的变化

图 3 血清对Ca-siRNA复合物作用的影响(×100)

A: The fluorescence microscope images of Ca-siRNA transfection in the medium with and without serum for 6 h; B: The GFP fluorescence intensity observation after 48 h

Fig 3 Influence of serum on Ca-siRNA complex(×100)

A：扫描电镜观察Ca-siRNA在NTs表面的分布； B：激光共聚焦观察Ca-siRNA(Cy3)的分布

A: Scanning electron microscope images of the Ca-siRNA complex distribution on NTs surface; B: Confocal laser scanning microscope images of Ca-siRNA (Cy3 labeled) distribution

Fig 4 Surface characterization of the decorated titanium implant

A：诱导分化7 d后ALP染色； B：ALP染色图的半定量分析相对活性

3 讨 论

种植体表面生物修饰自提出后就备受关注，被认为是未来种植体表面设计的重要趋势之一[8]，不同于生长因子、粘附分子等非特异性作用，RNAi的应用极大程度上解决了靶向骨形成的问题[9-10]，因此siRNA/miRNA功能化的植入材料具有良好的应用前景。然而裸露的siRNA/miRNA依赖于高效的转运载体，也成为其在材料功能化中应用的瓶颈。因此，大量的研究集中在纳米载体的开发，主要包括以阳离子脂质体为代表的lipoplex复合物以及以阳离子聚合物为代表的polyplex两大类[11]。这些纳米载体的设计、合成较为复杂，成本较高且作用机理难以完全阐明，制约了其应用范围。

钙离子作为内源性的阳离子，发挥重要的生理功能，Hori等[12]首先报道了富含钙离子的培养液中寡核苷酸的作用得到显著增强；随后Ruvinov等[13]首次系统性阐明了钙离子转运siRNA相关的纳米材料学特性；本课题前期的研究首次在MSCs中也观察到了该现象，证实了钙离子的特殊效应[7]。本研究也发现在一定钙离子浓度的培养基中，裸露的siRNA对靶基因的沉默效率可显著提升，与前期的研究结果一致；当钙离子浓度控制在合适的范围内时，可出色的实现靶基因高效沉默，同时对细胞活力不产生显著影响，这在一定程度上优于商品化的脂质体2000，而钙离子成本低廉，这为后期的应用提供了可能性。关于钙离子的作用机制虽有相关报道，但对于血清的关键作用缺乏描述。事实上，高浓度钙离子可对细胞造成严重损伤，一方面高浓度钙离子引起细胞外渗透压增加，引起细胞损伤[14]；另一方面，带正电的钙离子可与带负电的生物大分子结合，高浓度钙离子引起生物分子功能障碍[15]。本研究在无血清培养基中可以观察到大量细胞破裂，且破裂的碎片与siRNA的分布一致，这提示高浓度钙离子可能与某些细胞成分相结合造成细胞破裂。而当有血清存在时，高浓度钙离子的损伤则被完全消除，出现了理想的RNAi现象，这一方面证实了血清对高浓度钙离子的损伤具有保护作用，另一方面可能对siRNA作用的发挥至关重要。事实上，血清中BSA可与钙离子结合，缓冲其对细胞造成的渗透压损伤[16]，可以推测，钙离子-siRNA-血清蛋白三者可共同形成复合物进入细胞内发挥siRNA功能，这也是许多利用钙离子作为桥接作用制备聚阴离子-Ca-siRNA纳米复合物的基础[17]。在脂质体2000等许多商品化转染试剂的使用中，均建议使用无血清或低血清培养基进行转染，而钙离子则与之相反，这也为实际的应用提供了便利。

钛种植体阳极氧化后可形成规则的纳米管结构，本身对MSCs的功能具有调控作用，更为重要的是氧化后的表面呈现超亲水特性，为水溶性的Ca-siRNA复合物吸附提供了基础。扫描电镜观察证实Ca-siRNA复合物可成功吸附于NTs表面，呈现相对均匀分布，与前期的研究观察一致。简单吸附的方法加载可在短期内将Ca-siRNA复合物释放出来，局部形成足够的钙离子浓度，这是siRNA功能的发挥的前提；采用antimiR138修饰后的种植体表面显著提升了MSCs的ALP活性，提示其成骨分化得到显著增强。事实上利用siRNA/miRNA分子促进MSCs的成骨分化研究已有广泛报道[18]，然而如何选择合适的分子进行加载尚缺乏特定要求。本研究所采用的细胞为端粒酶缺失永生化的MSCs，antimiR138最早被证实在该细胞的成骨分化中发挥关键作用[19]，本课题前期的研究筛查也证实了这一点[7]，然而后期对于特定细胞以及特定功能的需求状态下，具体siRNA/miRNA的选择尚需要进一步明确。

综上所述，本研究探明了单纯应用钙离子转运siRNA的相关特性，即安全、高效、简便、廉价；应用Ca-antimiR138进行种植体表面修饰后，可显著提升其骨诱导特性，为种植体表面生物修饰的应用提供了新思路。