高糖对大鼠肾间质成纤维细胞PINCH-1表达的影响

谢荣 张和平 刘晓惠 刘佳丽 李沁芸

637000 南充，川北医学院附属医院肾内科(谢荣，张和平，刘晓惠，刘佳丽，李沁芸)；637100 南充，川北医学院(谢荣)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的并发症之一，是多种因素共同参与作用的结果。其中，肾间质纤维化在糖尿病肾损伤中作为一个独立因素，可导致肾功能恶化，主要病理特点表现为肾间质成纤维细胞增生，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度聚集。整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是胞浆内的转导蛋白，它作为多蛋白体中的支架，通过不同的信号转导导致细胞多种生物活性改变。国内外研究证实ILK参与了糖尿病肾小球早期硬化、系膜细胞增生、ECM聚集、氧化应激、足细胞损伤、血管内皮细胞增殖等多种信号通路，在糖尿病患者的肾脏损伤中发挥了重要作用[1]。PINCH-1(particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)蛋白是ILK的专属伴侣，在蛋白水平上可以调节ILK的活性，PINCH-1、ILK形成的PINCH-ILK-α-Parvin复合物在整合素信号的传导中，介导细胞增生、黏附、ECM聚集[2-3]，是肾小管上皮间充质转化过程中的关键调节点。但目前关于PINCH-1蛋白在DN的研究尚未见报道。本研究观察高糖刺激对大鼠肾脏成纤维细胞PINCH-1、ILK表达的影响，以及肾间质成纤维细胞表型转化、ECM相关蛋白分泌的影响，探索PINCH-1蛋白在DN发生发展中的作用及可能机制。

材料与方法

一、材料与试剂

正常大鼠肾间质成纤维细胞株(NRK49F)购自上海通派生物科技有限公司。H-DMEM、L-DMEM培养基购自Hyclone公司；兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗体、兔抗大鼠ILK多克隆抗体、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗体购自Abcom公司；SP-免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司；PINCH-1引物、ILK引物、β-Actin引物、α-SMA引物、逆转录试剂盒、Taq聚合酶购自大连宝生物公司；大鼠FN、Col I ELISA试剂盒购自R&D公司。

二、方法

1.细胞培养 用含10%灭活胎牛血清L-DMEM培养基培养NRK 49F细胞。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育，每2～3 d换液1次，3～5 d传代1次。

2.实验分组与处理 实验前24 h将培养液换成L-DMEM无血清培养液培养，使细胞同步化。(1)高糖组用10%FBS高糖DMEM培养基培养，同时作低糖组，分别取0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h的标本(每组设3个复孔)进行实验。(2)用含10%FBS的不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)DMEM培养基，分成三组(每组设3个复孔)培养48 h后，进行实验。

3.RT-qPCR检测PINCH-1、ILK mRNA的表达 TRIZOL提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR，检测PINCH-1 mRNA、ILK、α-SMA mRNA表达水平。引物序列为：PINCH-1上游引物5′-TGGACATCGCCATTATGAGAGG-3′，下游引物5′-CAAGTGGAACAGGCAAAGCAG-3′，目的片段长度162 bp；ILK上游引物5′-TACAAACAGACGCTCAGCAGACA-3′，下游引物5′-TGGTGGGATAGTAGGCCGAAG-3′，目的片段长度145 bp；α-SMA上游引物5′-GAAGAGTTACGAGTTGCCTGATG-3′，下游引物5′ -ATGATGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′，目的片段长度138 bp；β-Actin上游引物5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，目的片段长度155 bp。real-time RT-PCR按照RocheFastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书进行，相对基因表达采用2-ΔΔCT法计算。

4.免疫细胞化学法检测PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表达 将处于对数生长期的细胞，用胰酶消化后，以1.0×105个/mL的密度接种到爬片上进行培养。细胞化学染色时吸出培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定细胞20 min，PBS清洗2 min×3次；0.3% Triton X-100浸泡5 min细胞破膜，PBS漂洗2 min×3次；3% H2O2封闭过氧化物酶10 min，PBS漂洗2 min×3次；正常山羊血清封闭20 min(室温)；吸除多余的血清，分别滴加一抗，包括兔抗大鼠PINCH-1多克隆抗体(1∶200)、兔抗大鼠ILK多克隆抗体(1∶200)、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗体(1∶100)，放于湿盒中4 ℃冰箱过夜；常温下复温，PBS漂洗2 min×3次，吸除爬片上多余的液体，滴加生物素化山羊抗兔/小鼠IgG二抗，37 ℃，避光孵育20 min，PBS漂洗2 min×3次；吸除爬片上多余的液体，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，孵育20 min；DAB镜下显色3～5 min，自来水充分冲洗；苏木素复染细胞核约15 s，自来水冲洗；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下拍照记录并进行蛋白半定量分析。

5.ELISA法检测FN、Col I蛋白的表达 取出细胞爬片之前，收集各组细胞上清液，3 000 r/min 离心，按照ELISA试剂盒说明书操作，于波长450 nm的全光谱分光光度计上读取各孔的A值，检测FN、Col I的蛋白含量。每组设6个复孔，以其均值作为统计数据。

三、统计学处理

结 果

一、高糖刺激成纤维细胞不同的时间对PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA表达的影响

高糖刺激成纤维细胞6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，分别以0 h作对照，低糖组PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA在各时间点的表达无明显差异(P>0.05)。高糖组PINCH-1、ILK mRNA表达均在6 h后显著增加，与低糖组比较，差异有显著统计学意义(P<0.05)。高糖组α-SMA mRNA表达呈时间依赖性增加，在72 h达高峰(P<0.05)。(图1、图2、图3)

图1 高糖组和低糖组不同作用时间PINCH-1 mRNA的相对表达量

图2 高糖组和低糖组不同作用时间ILK mRNA的相对表达量

图3 高糖组和低糖组不同作用时间α-SMA mRNA的相对表达量

二、不同浓度的葡萄糖刺激成纤维细胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表达情况

不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、15.0 mmol/L、25.0 mmol/L)刺激成纤维细胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的表达呈浓度依赖性增加，高糖组(25.0 mmol/L)PINCH-1 mRNA表达量是低糖组(5.5 mmol/L)的(1.98±0.09)倍，高糖组ILK mRNA表达量是低糖组的(2.34±0.16)倍，高糖组α-SMA mRNA表达量是低糖组的(5.86±0.84)倍，差异均有统计学意义(P<0.01)。(图4)

注：与5.5 mmol/L葡萄糖浓度组比较，aP<0.01图4 不同浓度葡萄糖刺激成纤维细胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA mRNA的相对表达量比较

三、高糖刺激成纤维细胞不同的时间PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表达情况

免疫细胞化学染色显示正常大鼠肾脏成纤维细胞胞浆中PINCH-1、ILK蛋白呈低水平表达，α-SMA蛋白几乎无表达。高糖刺激能明显增加PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白表达，并随着时间延长，呈一定递增趋势，高糖刺激成纤维细胞48 h时，PINCH-1蛋白水平达最高峰，刺激24 h时ILK蛋白水平达最高峰，刺激72 h时α-SMA蛋白水平达最高峰，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。(表1)

四、不同浓度的葡萄糖刺激成纤维细胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表达情况

不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L)刺激成纤维细胞48 h后，PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的表达均呈浓度依赖性增加，差异有统计学意义(P<0.05)。(表2)

表2 不同浓度葡萄糖刺激NRK49F细胞48 h后PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相对表达量比较

注：与5.5 mmol/L葡萄糖组比较，aP<0.05，bP<0.01

五、高糖刺激成纤维细胞不同的时间FN、Col I的表达情况

ELISA法测定结果显示高糖刺激能明显增加ECM主要成分FN、Col I蛋白的表达。高糖刺激成纤维细胞6 h后，FN蛋白的表达呈时间依赖性增加；高糖刺激成纤维细胞12 h后，Col I蛋白表达呈明显递增趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。(表3)

讨 论

DN是糖尿病患者最主要的致死因素，是终末期肾脏病的常见病因。在糖尿病肾间质纤维化过程中，肾脏固有细胞发生功能和表型改变，转变为可表达α-SMA的肌成纤维细胞，合成ECM能力显著增强，α-SMA目前被认为是预测肾间质纤维化预后的最好指标[4-5]。早期延缓甚至逆转肾间质纤维化对DN的防治具有重大的意义。转化生长因子-β1(tansforming growth factor beta-1，TGF-β1)是成纤维细胞活化和肾间质纤维化的重要启动和促进因子。高糖刺激能够促进TGF-β1高表达，体外研究证实，在系膜细胞中，TGF-β1诱导的PINCH-1、ILK、α-parvin的表达增加，PINCH-1、ILK、α-parvin形成的PIP复合体增加，FN和ECM沉积明显增加[6-7]。Kim等人[8]进一步研究发现，在TGF-β1诱导的早期，PINCH-1、ILK在系膜细胞的表达明显增加，之后开始下降，同时细胞周期抑制蛋白p27 Kip1的定位和Akt、p38磷酸化发生改变，推测TGF-β1通过调节PINCH-1、ILK的表达，参与调节系膜细胞增殖和肥大。用TGF-β1刺激足细胞，PINCH-1、ILK形成的复合体下调，细胞凋亡蛋白酶-3活性增强，证实PINCH-1抑制足细胞凋亡[9]。Li等[10]证实，用外源性PINCH-1刺激肾小管上皮细胞，E-钙黏蛋白表达下降，FN的表达明显升高，PINCH-1在肾小管上皮细胞间充质转化中发挥了重要的作用。在原发性肾小球肾炎肾组织中，PINCH-1的表达随着肾间质纤维化程度加重而进行性增加，范围增大[11]。这些研究表明PINCH-1在TGF-β1调控下，与ILK相互作用参与肾间质纤维化的发生发展，在不同类型的肾脏细胞中产生不同的效应，影响细胞行为。

表1 高糖刺激NRK49F细胞不同时间PINCH-1、ILK、α-SMA蛋白的相对表达量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组12 h比较，bP>0.05；与高糖组24 h比较，cP>0.05

表3 高糖刺激NRK49F细胞不同时间FN、Col I蛋白的表达量比较(μg/L)

注：与对照组比较，aP<0.05

本研究发现，在低糖环境下，PINCH-1在NRK49F细胞中少量表达，α-SMA几乎无表达，ECM主要成分FN、Col I呈低水平表达，在高糖刺激下，PINCH-1蛋白的表达较低糖组明显增加，纤维化相关蛋白α-SMA、FN、Col I的表达持续增加，呈一定时间依赖性和浓度依赖性，说明高糖能够促进PINCH-1的表达，高糖刺激促进肾脏成纤维细胞表型转化，分泌大量的ECM成分。本研究进一步证实PINCH-1参与早期高糖诱导的肾间质纤维化。本研究结果发现，在高糖刺激下，PINCH-1在NRK49F细胞中的表达达到峰值后有所下降，但其机制尚不清楚。这一现象可能与PINCH-1在高糖刺激的NRK细胞中不同时期发挥的主要效应不同有关，表现为抑制细胞凋亡、促进细胞存活[9]。下一步的实验，将重点对此进行深入研究。

此外，本研究发现，ILK在高糖诱导的大鼠肾脏成纤维细胞的表达，与PINCH-1的表达具有协同作用。ILK在高糖刺激下，呈一定时间依赖性增加，达到一定的峰值后，表达有所下降，而在不同葡萄糖浓度下，呈浓度依赖性增加。有研究证实，ILK和α-SMA在高糖培养的肾小球系膜细胞和链脲霉素诱导的大鼠肾脏组织中，表达明显增加[12]，抑制ILK的表达，FN、α-SMA的表达均明显下降，从而延缓高糖诱导的肾小管上皮细胞间充质转化[13]。我们的研究结果与ILK在其它肾脏固有细胞的研究结果相符合，证实了ILK在DKD整个发生发展过程中的重要地位。本实验中PINCH-1与ILK表达的一致性得到证实，为PINCH-1参与DKD的发病提供了更充分的依据。

结合近些年的研究，本课题组推测，在高糖刺激下，PINCH-1、ILK可能通过TGF-β1的调节表达上调，形成的PIP复合体促进肾间质成纤维细胞活化，ECM大量聚积，参与DN患者肾间质纤维化的发展。因此，PINCH-1可能成为未来治疗DN的新靶点。