解磷细菌的分离筛选及培养条件优化

郑喜清 邸娜 张志超 纪晓贝

摘    要：通过透明圈法与钼锑抗比色法，从巴彦淖尔市临河区旧气象局试验田植物根际土中分离筛选出3株解磷效果好的菌株，通过单因素试验对菌株培养条件进行了优化。结果表明：不同碳源、氮源、温度、pH值、盐浓度等对其解磷效果存在显著差异。PB1以木糖做碳源、硝酸铵为氮源、NaCl浓度为0.3 g·L-1、pH值为6、温度30～34 ℃、加液量为100 mL时解磷效果最显著;PB2以果糖做碳源、硝酸铵为氮源、盐浓度为0.7 g·L-1、pH值为6、温度30～34 ℃、加液量为50 mL时最显著。PB3以葡萄糖或果糖做碳源、硝酸钠为氮源、盐浓度为0.5 g·L-1、pH值为6、温度32 ℃、加液量为100 mL时解磷效果最显著。根据形态特征及生理生化特性，结合《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》将3种菌株初步鉴定为：PB1为沙门氏菌、PB2为金杆菌属、PB3为芽孢杆菌属。

关键词：解磷菌;条件优化;解磷能力

中图分类号：S144.9         文献标识码：A            DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.004

Isolation and Screening of Phosphate-solubilizing Strains and Optimization of Culture Conditions

ZHENG Xiqing， DI Na，ZHANG Zhichao， JI Xiaobei

（Agriculture Department， Hetao College， Bayannaoer， Inner Mongolia 015000， China）

Abstract： Through transparent circle method and molybdenum antimony colorimetric method， 3 strains with good phosphorus-solubilizing effect were isolated and screened from the rhizosphere soil of  plants， in the experimental field of Linhe District of Bayannaoer City. The culture condition of strain was optimized by single factor test.The results showed that different carbon sources， nitrogen sources， temperature， pH and salt concentration had significant differences in their phosphorus removal effects. When PB1 used xylose as carbon source， ammonium nitrate as nitrogen source， NaCl concentration was 0.3 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. PB2 was most significant when fructose was used as carbon source， ammonium nitrate was used as nitrogen source， salt concentration was 0.7 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34 ℃， and liquid dosage was 50 mL. When PB3 used glucose or fructose as carbon source， sodium nitrate as nitrogen source， salt concentration was 0.5 g·L-1， pH is 6， temperature was 32 ℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. According to the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics， combined with the Manual for Identification of Common Bacterial Systems and Berger's Manual for Identification of Bacteria， the three strains were preliminarily identified as： PB1 was Salmonella， PB2 was Bacillus genus， and PB3 was Bacillus.

Key words： Phosphate solubilizing Bacteria;medium optimization; phosphate dissol- ving ability

磷是植物生長所必需的矿质元素，在植物生长、发育等生命活动中起着积极的作用。在我国74%的耕地土壤缺磷，其中95%的土壤中的磷以难溶态形式存在，很难被植物直接吸收利用。土壤中可被植物吸收利用的磷仅占全磷量的1% 。磷肥施入土壤后，土壤胶体对无机磷有强烈的吸附和固定作用，转变成植物难以吸收利用的无效态磷，导致土壤中肥料比例严重失调、土壤板结及退化、磷肥利用率低[1-2]。因此，如何开发和有效利用这部分被土壤固定的磷是目前我国农业生产中急需要解决的问题。大量研究表明，土壤中存在大量的溶磷微生物，包括细菌、放线菌和真菌，可以将土壤难溶性的磷转变成植物可以吸收利用的可溶性磷[3-4]，达到提高土壤磷素有效性、使作物增产的目的[5-7]。目前，己报道的具有较强溶解难溶磷酸盐的菌株有芽抱杆菌属、埃希氏菌属、青霉属，我国主要应用解磷巨大芽抱杆菌（Bacillus megatarium）生产溶磷生物肥料[8]。

由于解磷菌具有有效解磷、促植物生长能力以及不易导致环境污染与资源浪费等优势，以往很多研究者一直致力于开发解磷菌剂以制备更高效的生物磷肥来改善目前的不良状况。但是，到目前为止，解磷菌剂的应用还存在一些问题，实验室中解磷菌的培养条件与自然土壤的环境条件差别太大，培养基中的营养成分非常丰富，导致解磷菌在土壤这样相对寡营养的条件下不能很好地发挥作用。因此，本试验从土壤中分离筛选解磷效果好的菌株，研究生理生化特征，并对其进行培养条件优化，确定合适的碳源、氮源、温度、pH值、盐浓度、装液量对解磷能力的影响，结合形态特征和生理生化指标进行分类鉴定，为微生物菌肥的工业化生产提供一定参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试土样

土样来源于巴彦淖尔市临河区旧气象局试验田种植的西红柿、尖椒、青椒、茄子、西兰花、黄瓜6种植物的根际土。采用5点取样法，除去表层土壤取样，混匀，放入自封袋中，带回实验室备用。

1.2 培养基

LB液体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH值 7.0～7.2，蒸馏水1 000 mL，121 ℃，灭菌30 min，固体培养基加琼脂15～20 g。

有机磷液体培养基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4  0.5 g、KCl 0.3 g、NaCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·4H2O 0.03 g、CaCO3 5.0 g、卵磷脂0.2 g、蒸馏水1 000 mL、pH值 7.0～7.5，固体培养基加琼脂15～20 g。

无机磷液体培养基：葡萄糖10.0 g、Ca3（PO4）2 5.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.5 g、蒸馏水1 000 mL、pH值 6.8～7.2，固体培养基加琼脂15～20 g。

1.3 土壤中解磷菌分离

称取10 g土样溶于90 mL无菌水中，震荡30 min后，取上清液按10倍稀释法稀释样品，每个浓度取0.1 mL分别涂布到分离培养基上[9]，28 ℃下培养5 d。观察生长情况，记录出现透明圈的菌落，再挑取有明显透明圈的菌落，进一步通过划线法纯化，直至得到纯菌株后，转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，保存于4 ℃冰箱中[10]。

1.4 解磷能力测定

溶磷菌初筛：将分离纯化后的菌株接种到有机磷、无机磷培养基上，28 ℃培养5 d，通过溶磷圈法测量解磷圈直径（D）与菌落生长直径（d）比值大小，初步筛选具有溶磷能力的菌株。

溶磷菌复筛：将初筛得到的解磷菌株接种到磷液体培养基中，对照加等量的无菌水，接种后28 ℃，160  r·min-1摇床培养5 d，培养好的磷细菌液1.2万r·min-1离心5 min，取上清液，根据钼锑抗比色法测定上清液中溶磷量[10-11]，进一步判断溶磷能力。

1.5 菌株鉴定

形态特征鉴定：将菌株划线接种于LB平板上，于28 ℃恒温培养1～2 d，观察单菌落的形态特征，另取新鲜培养物进行革兰氏染色，觀察其显微形态。

生理生化特性鉴定：淀粉水解、甲基红反应、明胶水解、氧化酶活性测定、过氧化氢试验、柠檬酸盐利用试验、运动性和需氧性测定等生理生化试验参照文献[12-13]的方法进行。

1.6 培养条件优化[14-16]

以磷培养基为基础，分别对碳源、氮源、温度、pH值、盐浓度、装液量采用单因素试验进行优化，供试因素及水平见表1，每个处理3次重复，相同条件下培养5 d后，测定解磷能力，从而确定最佳的碳源、氮源、温度、pH值、盐浓度、装液量。

1.7 数据处理与分析

采用Exce12003、SPSS17.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 解磷菌的筛选

在巴彦淖尔市临河区旧气象局试验田西红柿、尖椒、青椒、茄子、西兰花、黄瓜6种植物的根际土中筛选到解磷菌株15种。通过透明圈大小初步筛选出3种解磷效果较好的磷细菌，编号分别为PB1、PB2、PB3（图1）。

2.2 磷含量标准曲线

由图2可知，磷含量标准曲线回归方程为y=0.502 2x+0.002 5，相关系数为R2=0.999 2，表明两者线性相关良好。

2.3 解磷能力测定

溶磷圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d），是表征解磷细菌的相对解磷能力的一个指标，可以初步确定其解磷效果。由表2可知，PB2溶磷圈直径（D）与菌落生长直径（d）比值最大为1.18，解磷能力最强，其次是PB3，PB1最小。根据磷标准曲线计算出有效含磷量，结果表明PB1有效含磷量最高为1.567，解磷效果最好，其次PB2，PB3解磷效果最差。

2.4 菌株形态鉴定

PB1、PB2、PB3三种菌株菌落与培养基结合程度都较为良好，湿润、乳白色、表面均较为平整、无隆起、正反面无色差、不透明，其中除PB3外，其他2种菌落边缘都不规整。

由图3可知，PB3为长杆状、有分枝，PB1短杆状、有芽孢，PB2短杆状。3种菌革兰氏染色均为阳性。

2.5 生理生化特性鉴定

由表3可知，3个菌株淀粉水解、明胶水解、过氧化氢试验反映均为阴性;甲基红反应PB2为阴性，PB1、PB3均为阳性;柠檬酸盐试验、运动性测定PB1为阳性，PB2、PB3均为阴性;氧化酶活性PB2为阳性，PB1、PB3均为阴性;PB1为兼性厌氧，PB2、PB3均为好氧型。