黑血3D DANTE-CUBE磁共振管壁成像技术

对动脉粥样硬化血管重复扫描的实验研究

常 乐 陈录广 彭雯佳 李 帅 陈士跃 陆建平

随着磁共振成像技术的发展，各类高分辨黑血磁共振血管壁成像技术（magnetic resonance vessel wall imaging，MR-VWI）层出不穷[1-2]，实现了对动脉管壁的直接可视化评估，能够定性和定量评价动脉粥样硬化斑块成分及斑块稳定性等特征[3]。延迟交替进动的定制激发技术（delay alternating with nutation for tailored excitation，DANTE）早期用于高分辨磁工作波谱实验，进行选择性的激发窄带宽的频率区域。随后该技术在磁共振成像中饱和组织信号进行一维或二维的空间标记，它能够抑制流动自旋质子的信号，同时能最大程度地保留静止自旋质子的信号[4]。本研究运用3D DANTE-CUBE管壁成像序列对新西兰大白兔的腹主动脉管壁进行可重复性分析，探讨该MR-VWI技术在动物实验中定性和定量评价的稳定性和可靠性。

方 法

1.实验动物

选用8只健康的成年新西兰大白兔作为实验对象，雄性和雌性各4只，平均体质量为3.03±0.78kg，由海军军医大学实验动物中心提供并负责饲养。基础饲料适应性喂养2周后随机分为两组，实验组5只，后续对其腹主动脉制作动脉粥样硬化模型；对照组3只，始终基础饲料喂养。

2.实验组造模

实验组5只兔先行高脂饲料（基础饲料79.5%，猪油5%，蛋黄粉15%，胆固醇0.5%）喂养4周，自由饮水。然后采用内膜拉伤法制作腹主动脉的斑块模型，术前禁食12小时，术中利用异氟烷气体麻醉机（MSS-3S，上海任谊生物科技有限公司），麻醉浓度1.5%，流量计浓度0.5L/min，兔仰卧体位，腹股沟区脱毛消毒后切约3cm开口，确认股动脉后采用Seldinger技术穿刺插入导丝导管。将4F球囊扩张导管插入至腹主动脉约心脏下方水平2cm左右，球囊内缓慢充入生理盐水，感觉有阻力后缓慢拉出，反复3次。去除球囊，压迫止血后，伤口处撒少许青霉素粉末，缝合切口。术后肌注青霉素3天，预防感染。造模后继续高脂饲料喂养12周，而后行MRI检查。

3.MRI扫描

运 用 3.0T MRI扫 描 仪（Discovery MR750，GE Healthcare， Milwaukee），32通道腹部线圈覆盖躯干，俯卧位、尾先进，检查全程气体麻醉，第一次扫描（图1）2周后重复扫描一次（图2）。成像目标血管是腹主动脉，扫描序列包括：3D DANTE CUBE T1WI，冠状位扫描，扫描范围上至膈肌下至腹股沟下缘， TR/TE=1100.0/12.9ms，层厚1.2mm，层间距 0.6mm，层数 92，FOV=200×200mm2，采集矩阵=256×256，采集时间8min22s；3D DANTE CUBE T2WI序列，冠状位扫描， 扫描范围上至膈肌下至腹股沟下缘 ， TR/TE=2000.0/58.6ms，层 厚 1.2mm， 层 间 距 0.6mm， 层 数 84，FOV=200mm×200mm，采集矩阵=256×256，采集时间351秒。

4.图像测量

首先，针对第一次MRI扫描图像，“观察者1”（影像医学科副主任医师，从事心血管疾病影像学研究9年）定量测量一次，之后针对第二次MRI扫描图像，“观察者1”测量一次，以计算两次扫描的一致性；同时，针对第二次扫描，“观察者2”（影像医学科医师，从事心血管疾病影像学研究3年）测量一次，以计算观察者间的一致性；间隔2周后，针对第二次扫描，“观察者1” 再测量一次，以计算观察者内的一致性。具体测量方法（图3、4）：利用RadiAnt DICOM Viewer 4.2.1（Medixant， Poland）软件导入所有扫描序列，依次对冠状位扫描的DANTE预脉冲3D CUBE T1WI和T2WI序列进行横轴位重建，最后在重建的图像中进行定量评价，有斑块的血管以斑块最厚处为中心选取上下连续的6个层面测量，无明显斑块的血管则以右肾动脉开口下缘为起始向下选取连续的6个层面测量，测量参数包括腹主动脉的管腔面积（AL）、血管总面积（AT），计算管壁面积（AW）：AW=AL- AT。

5.病理检查

完成磁共振检查后将实验动物处死（10%KCl溶液1ml/kg耳缘静脉注射），解剖分离出主动脉，按相应解剖标志截取扫描范围内的腹主动脉，经生理盐水冲洗干净血凝块，将标本固定于10%中性福尔马林溶液，脱钙、整体包埋于石蜡中，连续切片（间距1mm，层厚10μm），从近心端开始依次编号，行HE染色。

6.统计学分析

所有数据采用SPSS 22.0和Medcalc 13.0统计软件进行分析。采用Kolmogorov-Smirnov方法对计量资料正态性检验，符合正态分布资料用（）表示。采用配对样本t检验比较两次扫描、观察者内和观察者间重复测量的差异性。统计组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）和变异系数（coefficient of variability，CV）评估一致性，ICC＞0.75表示一致性非常好，ICC在0.4～0.75之间表示一致性较好，ICC＜0.4表示一致性较差；CV＜15%表示一致性非常好。

结 果

实验组的1只新西兰大白兔在造模手术后死亡，1只兔在完成第一次磁共振扫描后死亡，最终实验组剩余3只兔和对照组3只兔完成所有实验项目并纳入统计分析。3D DANTE-CUBE序列可以清晰显示兔的腹主动脉管壁情况，3只实验组兔的腹主动脉局部可见管壁不均匀增厚、甚至偏心弧形斑块形成。定量测量相同水平范围的腹主动脉横轴位管壁面积，在DANTE-CUBE T1WI上测量的实验组管壁面积明显大于对照组（0.5195±0.1815 vs. 0.2863±0.3337，P＜0.001）， 在 DANTE-CUBE T2WI测量的实验组管壁面积也显著大于对照组（0.4671±0.1546 vs. 0.3030±0.0346，P＜0.001）。病理检查发现3只实验组的腹主动脉管壁内膜均不同程度偏心性增厚，厚薄不均的纤维斑块形成（图5），未见大的脂质核、斑块内出血或钙化等复杂成分。

所有完成实验的6只兔的重复扫描的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI测量的AL的一致性非常好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT（ICC＞0.4，CV=17.51%）和 AW 的一致性较好（ICC＞0.75，CV=16.87%）； 在 DANTE-CUBE T2WI测 量的 AL和 AW的 一 致 性 都 非 常 好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT的 一 致 性 较 好（ICC＞0.75，CV=17.65%）（表1）。观察者内的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI测量的所有血管壁参数的一致性都非常好（ICC＞0.75，CV＜15%）；在DANTE-CUBE T2WI测量的AL和AW的一致性非常好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT的一致性较好（ICC＞0.4，CV＜15%）（表2）。观察者间的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI和T2WI测量的所有血管壁参数的一致性都非常好（ICC＞0.75，CV＜15%）（表3）。

图1 模型组新西兰大白兔腹主动脉第一次扫描的3D DANTE-CUBE图像。A. DANTE-CUBE T2WI序列，白箭指示腹主动脉偏心斑块，虚白箭指示右肾动脉近端；B. DANTE-CUBE T1WI序列。图2 模型组新西兰大白兔腹主动脉第二次扫描的3D DANTE-CUBE图像，与图1为同一只兔。A. DANTE-CUBE T2WI序列；B. DANTE-CUBE T1WI序列，白箭指示腹主动脉偏心斑块。

图3 模型组新西兰大白兔腹主动脉3D DANTE-CUBE T2WI的重建及管壁参数测量。A. 冠状位扫描的DANTECUBE T2WI图像局部放大图，黄线指示腹主动脉斑块水平；B. DANTE-CUBE T2WI的横轴位重建图（A图黄线水平），白箭指示腹主动脉右侧壁偏心弧形斑块，斑块在T2WI上呈明显高信号（与肌肉信号相比）；C. 在DANTECUBE T2WI的横轴位重建图上测量管壁参数，勾画血管壁轮廓（绿圈）、软件自动测算出血管总面积（AT）为0.3868cm2，勾画血管腔轮廓（红圈）得到管腔面积（AL）为0.06535cm2。图4 模型组新西兰大白兔腹主动脉3D DANTE-CUBE T1WI的重建及管壁参数测量，与图3为同一只兔。A. 冠状位扫描的DANTE-CUBE T1WI图像局部放大图，黄线指示腹主动脉斑块水平；B. DANTE-CUBE T1WI的横轴位重建图（A图黄线水平），白箭指示腹主动脉右侧壁偏心弧形斑块，斑块在T1WI上呈等信号（与肌肉信号相比），结合图3表现（斑块在T2WI呈高信号），提示斑块成分主要为纤维化组织；C. 在DANTE-CUBE T1WI的横轴位重建图上测量管壁参数，勾画血管壁轮廓（红圈）、软件自动测算出血管总面积（AT）为0.3297cm2，勾画血管腔轮廓（绿圈）得到管腔面积（AL）为0.05519cm2。

图5 模型组新西兰大白兔腹主动脉的HE染色。A. 腹主动脉横切面全景图（×50），管腔内膜侧偏心性增厚（黑箭）；B. 为A的局部放大图（×200），可见血管内膜明显增厚（黑箭），主要是纤维化组织，包括胶原蛋白和平滑肌细胞，内膜深层的肌弹力层亦增厚。

表1 兔腹主动脉3D DANTE-CUBE MRI重复扫描一致性

表2 兔腹主动脉3D DANTE-CUBE MRI观察者内的一致性

表3 兔腹主动脉3D DANTE-CUBE MRI观察者间的一致性

讨 论

本实验利用高脂饲料加动脉内膜损伤法制作新西兰大白兔的腹主动脉粥样硬化模型，该模型技术相对成熟、造模效果确切，常用于对特定血管的动脉粥样硬化模型制作的动物实验中[5]，但相较于单纯高脂喂养的缺点是动物死亡率较高，笔者团队在实践中发现球囊拉伤术中要求操作者的手感轻柔、力度适中，术后预防性使用抗生素、在饲料中适量补充维生素粉剂可一定程度降低手术并发症。另外，本实验运用MRI兼容的动物专用气体麻醉机，气体麻醉的主要优点是麻醉效果好、麻醉持续时间容易掌握、动物苏醒快、不良反应较少，保障了在造模手术和MRI检查过程中的麻醉效果和动物安全。

DANTE序列是近来兴起的一种MR-VWI的黑血（血流信号抑制）技术[4，6]，它采用多个小角度非选择性激发脉冲与梯度脉冲作为运动敏感的磁化预准备，能够抑制流动自旋质子信号，其优点包括：能够抑制任何方向的血流信号；能够实现2D或3D MRVWI；脉冲链的射频激发角度较小，射频能量少，可行多层MRI；对射频场B1的不均匀性不敏感。另外，三维成像也是未来MR-VWI发展的趋势，与2D相比3D扫描有诸多优势，比如能够实现各项同性的空间分辨率（0.5～0.8mm3），具有较大的层方向上的成像覆盖范围，具有较高的信噪比与成像效率，可行任意方向的重建，且重建图像仍具有较高的空间分辨率。目前，主流的3D技术为可变翻转角快速自旋回波序列，不同MRI仪生产产商有不同的命名（通用医疗为CUBE，西门子医疗为SPACE，飞利浦医疗为VISTA），其原理与2D快速自旋回波成像技术类似，不同之处在于在层方向上施加相位编码梯度场用于层面选择，并且重聚焦脉冲采用了可变的射频翻转角。基于可变翻转角技术实现了各向同性的数据采集和提高成像时间效率，同时小角度射频脉冲降低了射频能量沉积。但是当遇到缓慢血流或复杂血流（如湍流）时，3D可变翻转角快速自旋回波序列常常信号抑制不充分，导致“假斑块”伪影，因此联合黑血技术使用可以克服这一缺点，本研究正是采用了联合3D大范围高效高分辨成像（3D CUBE序列）和血流抑制（DANTE预脉冲）的成像方法，而且扫描方向采用冠状位，实现在Z轴（主动脉走行方向）上尽量覆盖较大范围，提高了成像效率。

本研究验证了基于DANTE血流抑制的3D CUBE管壁成像序列能够定性和定量区分动脉粥样硬化管壁和正常动脉管壁，清晰显示管壁增厚和斑块形成，并且定量分析重复扫描对管壁评价的一致性较好，在同一个评价者不同时间定量测量的一致性也很好，在不同资历影像医师定量分析的一致性非常理想，说明本研究采用的高分辨3D DANTE-CUBE管壁成像序列在动物实验中表现非常稳定，将来需要转化应用于人的头颈部动脉粥样硬化斑块的评价和验证。在评价斑块成分方面，根据动脉粥样硬化斑块的MRVWI和病理研究结果[7-11]，多对比序列管壁成像可以准确判断斑块内的主要成分，通常选择同序列的肌肉组织信号作为比较标准，纤维化组织T1WI上呈等/低信号、T2WI上呈高信号，脂质核T1WI上呈等/高信号、T2WI上呈低信号，钙化T1WI上和T2WI均呈低信号，斑块内出血在早期（1周内）和近期（1～6周）T1WI上呈明显高信号、T2WI早期为等/低信号、近期也呈明显高信号，斑块内出血在慢性期（超过6周）T1WI和T2WI上均呈低信号。本研究的病理证实3只实验组新西兰大白兔的腹主动脉形成的斑块均为纤维化斑块，其信号均为T1等信号、T2高信号，符合纤维化组织成分的信号表现。

综上所述，本研究采用的3D DANTE-CUBE序列对动物的动脉管壁可以清晰显示和定量评价，可以精准定位增厚的管壁和动脉粥样硬化斑块，并且重复扫描、组内及组间的可重复性都达到良好水平，为将来的临床应用奠定了实验和技术基础。