白酒中氨基甲酸乙酯检测方法比较

尤小龙，胡 峰，钟 航，陈明学，程平言，钟方达

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水 564622）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又名尿烷（Urethane），是一种在食品发酵和储藏过程中会自然生成的污染物[1-2]，据动物实验都证明了其对肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病有潜在致癌风险[3-4]。大部分发酵食品均存在EC 的污染[5-6]，食品添加剂联合专家委员会评估从酒精饮料中的EC 平均摄入量是80 ng/kg 体重·d，虽未超过致癌较低置信区间基准剂量的0.3 mg/kg 体重·d，但酒精饮料中EC 含量已经足够引起相关部门重视[7-8]。2007 年欧洲食品安全管理局的报告，人类在食物中摄入的EC 约17 ng/kg 体重·d，如饮酒则可达到65 ng/kg 体重·d。目前，真菌毒素和EC 都被视为食品安全中的重要问题[9]，我国暂时参照加拿大的国际限量标准对EC进行控制，尚未制定有关EC的强制性标准[10]。

白酒是我国传统的蒸馏酒，也是我国特有的传统酒种，具有独特的工艺和风格，以其优异的色、香、味、格受到广大饮用者的喜爱，白酒中氨基甲酸乙酯检测准确性直接关乎消费者身体健康[11]。虽然我国目前未制定白酒中有关氨基甲酸乙酯的强制性标准，但是氨基甲酸乙酯的问题已经引起了厂家和消费者的普遍关注。白酒的传统工艺源远流长，酿造过程中使用多种原料辅料，其中部分含氮化合物会生成氨基甲酸乙酯前体物质继而被微生物转化为氨基甲酸乙酯，进入白酒中会造成潜在的食品安全风险[12-14]，因此选取采用灵敏度高、检测限低、实用性强的检测方法对酒企以及食品安全部门都异常重要。早期的用于检测EC 的气相色谱分析法与傅里叶变换红外光谱法稳定性较差且检出限较高[15]，本研究建立、使用稳定性和检出限均较为理想的HPLC 与GC-MS 检测分析方法，对两种方法的优劣进行对比，明确两种方法的准确性和适用范围，期望对我国氨基甲酸乙酯的相关标准制定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：本公司白酒产品，两款。

试剂：EC标准品（CAS：51-79-6，纯度99.50%），ChemService 公司；D5-氨基甲酸乙酯（CAS：73962-07-9），ChemService 公司；9-羟基占吨，分析纯；无水硫酸钠，分析纯；氯化钠，分析纯；正己烷，色谱纯；乙醚，色谱纯；乙腈，色谱纯；甲醇，色谱纯。

仪器设备：Agilent高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Agilent7890A-7000B 三重四级杆串联气质联用仪，美国安捷伦公司；无水硫酸钠小柱（2 g，6 mL），AN-PEL Laboratory Technology 公 司；OA-SYS 氮吹仪，上海安谱公司。

1.2 高效液相色谱（HPLC）方法

1.2.1 样品处理

准确吸取1.0 mL 酒样于试管中，加入100 μL 1.5 mol/L 盐酸溶液、600 μL 0.02 mol/L 9-羟基占吨溶液，混匀，室温下避光衍生60 min，经0.22 μm 有机滤膜过滤，滤液用于液相色谱测定。

1.2.2 色谱条件

（1）色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或等效色谱柱。

（2）柱温：30 ℃。

（3）激发波长：233 nm，发射波长：600 nm。

（4）流速：0.8 mL/min。

（5）进样体积：20 μL。

（6）高效液相色谱洗脱条件（表1）。

表1 梯度洗脱程序

1.2.3 标准溶液配制

准确称取0.0100 g 氨基甲酸乙酯，用无水乙醇溶解并定容至10 mL 混匀。0～4 ℃下保存。准确吸取氨基甲酸乙酯标准储备液，用40%乙醇溶液依次配制成20.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L、200.00 μg/L、400.00 μg/L的系列标准工作溶液。

1.2.4 标准曲线绘制

将各个浓度的标准曲线工作溶液依次进行HPLC 分析，对峰面积和浓度比绘制标准曲线得出回归方程与相关系数。

1.3 气相色谱-质谱联用（GC-MS）法

1.3.1 样品处理

准确称取2 g（精确至0.01 g）酒样，加入100 μL 2 μg/mL D5-氨基甲酸乙酯内标储备液，摇匀后加样到固相萃取柱上，抽真空，让试样渗入到固相萃取柱中，吸附10 min 后用15 mL 正己烷淋洗除杂，再用15 mL 5%乙酸乙酯/乙醚（v∶v）溶液洗脱并经过无水硫酸钠的萃取柱上脱水，收集于10 mL 离心管中，在室温下氮吹至0.4 mL 左右，用甲醇定容至1.0 mL，经有机相滤膜过滤后进样进行GC-MS分析。

1.3.2 仪器分析条件

7890B/7000C 三重四级杆气质联用仪，进样口温度220 ℃；色谱柱DB-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始温度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升至180 ℃，程序完成后240 ℃保持5 min；不分流进样，进样量1 μL；载气为高纯（≥99.999%）氦气（He），流速1 mL/min；电离方式：电子电离（electronionization，EI）源，离子源温度230 ℃。氨基甲酸乙酯监测离子（m/z）：44、62、74；D5-氨基甲酸乙酯监测离子（m/z）：64、76。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取0.0100 g 氨基甲酸乙酯标品，用甲醇溶解并定容至10 mL 混匀。配制为1 mg/mL 的氨基甲酸乙酯标准储备液。

准确称取10 mg D5-氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇定容至10 mL，配制为1 mg/mL D5-氨基甲酸乙酯贮备液；吸取0.1 mL 的1 mg/mL D5-氨基甲酸乙酯贮备液，用甲醇定容至50 mL 制得2 μg/mL 的D5-氨基甲酸乙酯储备液。

分别吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL 的1 mg/mL 的氨基甲酸乙酯标准储备液，加入1 mL 2 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯储备液，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制成质量浓度为10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L 的氨基甲酸乙酯标准系列溶液（内含200 μg/L的D5-氨基甲酸乙酯）。

1.3.4 标准曲线绘制

将10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L 的氨基甲酸乙酯标准系列溶液依次进行GC-MS 分析，以氨基甲酸乙酯浓度为横坐标，以相应浓度的峰面积与内标峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 仪器检测图谱观察

按照相应的条件进行实验，其中标样的HPLC图谱见图1，标样的GC-MS 总离子流图谱和质谱图见图2、图3、图4。由图3、图4 可知，两台HPLC与GC-MS 仪器对样品的响应均较为良好，可以满足实验要求。

图1 氨基甲酸乙酯标准液液相色谱图

图2 氨基甲酸乙酯及D5-氨基甲酸乙酯内标总离子流图

图3 氨基甲酸乙酯质谱图

2.2 线性关系及检出限

按照1.2.4 和1.3.4 的方法进行标准曲线的绘制，结果见图5、图6，其中Y 轴为峰面积，X 轴为浓度。

由图5 可知，HPLC 回归方程为y=0.0036x+0.0036，相关系数R2=0.9998，该标准曲线的线性关系较好，满足分析的要求。按信噪比S/N=3 推算，检出限为4.0 μg/L。

图4 D5-氨基甲酸乙酯内标质谱图

图5 液相色谱标准工作曲线

图6 气相色谱-质谱联用标准工作曲线

由图6 可知，GC-MS 回归方程为y=0.0049x+0.0113，相关系数R2=0.9998，该标准曲线的线性关系也较好，满足分析的要求。按信噪比S/N=3 推算，检出限为1.3 μg/L。

2.3 精密度与回收率验证

每个样品进行加标测定，取对照酒样DZ 5 mL，进行加标，加标量分别为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，加标后的样品进行两种方法的检测分析，每个样品按照1.2.1 和1.3.1 中样品处理方法重复处理4 次，进行平行试验，并根据结果计算其回收率与相对标准偏差，结果见表2 和表3。结果显示，HPLC 检测回收率在84.9%～105.1%之间，RSD 小于6.84%；GC-MS 检测回收率在95.3%～104.7%之间，RSD 小于4.26%。两种方法的准确性和重复性达到了实验要求，可以较为精准的检测出样品中的EC含量。

表2 HPLC测定加标样品结果

表3 GC-MS测定加标样品

2.4 实际样品的测定结果

取市购酒样5 种，每个酒样进行3 次测定，测定结果取平均值，测量结果见表4。由表4 可见，5 个酒样中均检测出了氨基甲酸乙酯，但是含量均未超过现行的加拿大、日本、法国等国针对蒸馏酒的限量标准150 μg/L。HPLC 平行3 次进样的结果RSD小于6.08%，GC-MS结果RSD小于3.56%。

表4 5种样品中氨基甲酸乙酯检测值

对两种检测方法的结果进行比较，用同一样品的结果差绝对值除以结果的平均值，同一个样品使用两种方法所测的样品结果偏差也均小于4.31%，两种方法检测结果差较小，再次证明两种方法的科学性和准确性。

2.5 方法小结

实验使用的2 个酒样中氨基甲酸乙酯分析方法，HPLC 回归方程为y=0.0036x+0.0036，相关系数R2=0.9998，检出限为4.0 μg/L，回收率在84.9%～105.1%之间，RSD 小于6.84%；GC-MS 回归方程为y=0.0049x+0.0113，相关系数R2=0.9998，检出限为1.3 μg/L，GC-MS检测回收率在95.3%～104.7%之间，RSD 小于4.26%。两种方法的准确性和重复性达到了实验要求，可以较为精准的检测出样品中的EC含量。

应用HPLC 和GC-MS 方法对市购的5 种酒样进行检测，得到了较为精确的测量结果，两种方法检测结果偏差均小于4.31%，方法的科学性和准确性得到证明。

2.6 方法对比

本研究应用两种方法进行氨基甲酸乙酯的测量，前文已经就两种方法的标准曲线、相关系数、回收率、RSD 值等测量结果的数据进行了计算和说明，将样品处理时间与进样时间统计后与其他因素一起列表进行比较，比较结果见表5。分析两种方法标准曲线，其相关系数皆为0.9998，都表现出了较好的线性关系；从检出限来看，HPLC 要比GCMS 大3.2 μg/L，这标示着GC-MS 法的应用范围更广，其也可用于检测EC含量较低的样品；分析两种方法的回收率和RSD 值，可以发现GC-MS 的回收率比HPLC要高6%左右，最大RSD值要低2.58%，故相对而言GC-MS方法的精确性和稳定性要略高于HPLC 方法。前处理时间和进样时间对比，GCMS 在总时间上要比HPLC 法缩短35 min，但是HPLC 法的前处理过程中有60 min 的等待时间，而且就前处理步骤而言HPLC 相对简单，总体上HPLC 法前处理操作更方便省事，但是如果样品数量庞大而需要结果的时间紧迫时，选用GC-MS 法可以更快地完成分析检测。

表5 HPLC与GC-MS方法实验参数对比

3 结论

本研究建立了HPLC 与GC-MS 两种白酒样品中EC 含量的检测方法，其中HPLC 法检出限为4.0 μg/L，回收率在84.9%～105.1%之间，RSD 小于6.84%；气相色谱-质谱检出限为1.3 μg/L，GCMS 检测回收率在95.3%～104.7%之间，RSD 小于4.26%。结果显示，两种方法的准确性和重复性均符合实验要求，但通过分析比较HPLC 法前处理操作更为方便，试剂毒性相对较低；但GC-MS方法的精确性和稳定性比HPLC 法更高，检出限更低，总体处理及进样时间更短，单位时间内能更快、更精确地对酒样中氨基甲酸乙酯进行检测。

通过两种方法检测5 种市购酒样，5 个样品都检测出了氨基甲酸乙酯，虽然没有超过国际标准，但暴露出我国白酒产品中的EC 食品安全隐患，随着白酒产业的发展与消费者的安全消费意识日益提升，人们对食品中EC 的关注也越来越强。白酒中EC 检测强制性标准的制定势在必行，在检测基础上的EC 控制方法研究也会成为白酒风险体系工作的重点之一。2017 年全国白酒规模以上酒企实现近6500 亿的销售额，预计未来3～5 年白酒行业将会持续增长，这意味着白酒中EC 的检测量会更加多、要求更严格，选用本文的HPLC 法与GC-MS法都能满足一般情况下的白酒检测需求，但在当前乃至未来3～5 年内选用GC-MS 法进行白酒氨基甲酸乙酯的检测更能满足相应的检测需求。