胞外聚合物在白腐真菌去除镉过程中的作用

吴 磊,张学洪,李宁杰,陈中维,兰 琪,刘 洁

(1.桂林理工大学 a.环境科学与工程学院;b.广西环境污染控制理论与技术重点实验室,广西 桂林 541006; 2.南京水利科学研究院，南京 210029)

0 引 言

随着现代工业的发展和人类的活动,环境中重金属污染越来越严重[1]。微生物对重金属具有吸附和转化作用,可以将其从废水中去除,已发现的用于重金属离子吸附的微生物数量众多,主要有细菌、真菌和藻类[2-5]。

胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)是微生物在特定条件下分泌并附着在细胞表面或周围的多聚化合物,其组分一般以多糖、蛋白质和腐脂类等为主[6-7]。由于这些大分子物质的存在,EPS含有丰富的官能团(如羟基、羧基、氨基等),在微生物对重金属离子的积极防御和去除中都有重要的作用[8-9]。

由于白腐真菌对重金属有较强的吸附能力,使其在微生物修复重金属污染的研究中受到了广泛的关注[10-11]。虽然EPS作为白腐真菌与环境接触的最直接桥梁,然而目前对EPS在白腐真菌去除重金属过程中的具体作用却并不明确,多是引用细菌EPS的作用来解释实验现象。据曹秀芹等[12]报道,活性污泥中细菌EPS的70%～80%是由蛋白质和多糖构成,余下的20%～30%来自于腐殖酸、核酸和脂类等。另据陈苗苗等[13]报道,冬虫夏草CordycepssinensisEPS中以多糖为主,含有少量其他物质。由此可见,细菌与真菌的EPS之间有很大差别。因而有必要对白腐真菌EPS在重金属污染修复中的作用进行详细的研究。

本文采用白腐真菌的模式菌种——黄孢原毛平革菌进行镉的去除试验,通过分析胞外聚合物(EPS)去除镉的含量占菌体去除总镉量的比例来研究黄孢原毛平革菌EPS在镉去除过程中的作用。重金属胁迫会影响微生物EPS的组成[14],这可能进一步影响EPS在微生物去除重金属过程中的作用,因而本研究将进一步分析镉胁迫下EPS中各组分变化,并对EPS各组分含量与EPS去除的镉含量进行相关性分析,从而得出镉胁迫下菌体EPS各组分在去除镉过程中发挥的具体作用。

1 材料与方法

1.1 菌种的培养

黄孢原毛平革菌(PhanerocheatechrysosporiumBKMF-1767)保存在葡萄糖土豆琼脂培养基上。 使用微量元素液体培养基培养,具体配制如下(L-1): 2 g KH2PO4、0.1 g CaCl2、0.5 g MgSO4、0.115 g FeSO4·7H2O 、0.112 g MnSO4·H2O、0.089 g ZnSO4·7H2O、0.05 g CuSO4·5H2O、0.001 g维生素B1、0.206 g C4H12N2O6、10 g葡萄糖,pH 4.5。 试验中使用的药剂均为分析纯,溶液全部使用超纯水配制。

培养液经121 ℃高温蒸汽灭菌30 min后,每200 mL接种2 mL孢子悬液,于650 nm波长下吸光度为0.5,置于恒温振荡培养箱中培养(30 ℃、180 r/min),48 h后加入Cd(NO3)2溶液,使培养液中Cd2+浓度分别为0、10、25、50、100 mg/L,并定时取样。 每个浓度设置3个平行样。

1.2 EPS的提取及菌球干重的测定

采用高速冷冻离心法提取黄孢原毛平革菌EPS,培养得到的菌球经超纯水清洗后再加入一定体积的超纯水,在高速冷冻离心机10 000 r/min下离心20 min,得到的上清液即为EPS溶液。 对提取EPS后的菌球进行真空冷冻干燥至恒重,测得菌球干重。

1.3 多糖、蛋白质浓度的测定

EPS溶液中多糖浓度采用蒽酮硫酸比色法测定,在波长620 nm下比色,以葡萄糖作为标准物质。EPS溶液中蛋白质浓度采用考马斯亮蓝G250法测定,在595 nm波长下比色,以牛血清蛋白作为标准物质。

1.4 镉的测定

镉浓度采用电感耦合等离子体发射光谱仪(PerkinElmer Optima 7000DV,美国)测定,测定前对样品进行酸化预处理并经0.45 μm滤膜过滤。

1.5 菌体扫描电镜及X射线能谱仪分析

采用场发射扫描电镜(Zeiss Σigma,德国)和X射线能谱仪(Oxford Inca,英国)分别对100 mg/L Cd2+胁迫下未提取EPS和已提取EPS的菌体进行形貌观察以及微区成分分析,其中样品镀金膜时间为50 s。

2 结果与讨论

2.1 EPS对镉的去除作用

由图1可知,在10和25 mg/L Cd2+实验组中,EPS去除镉量占菌体去除镉量的比例最高分别为37.4%和39.3%;在50和100 mg/L Cd2+实验组中,该比例最高仅为23.7%和7.7%。镉初始浓度越高,黄孢原毛平革菌去除镉过程中,菌体EPS去除的镉量占菌体去除镉总量的比例越低。该比例在培养初期呈现持续增长的趋势。这表明EPS在黄孢原毛平革菌去除镉初期发挥着更重要的作用,且在低浓度镉的去除过程中作用更大。

图1 不同培养时间下EPS去除镉量占菌体去除镉总量的比例Fig.1 Proportion of removal amount of Cd by EPS to total Cd2+ amount by Phanerocheate chrysosporium at different culture times

2.2 镉胁迫下EPS的组分含量变化

在EPS组分中,蛋白质含量相对较少,多糖是主要成分。 由图2a可知,在黄孢原毛平革菌培养5 d后,对照组中含量为0.77 mg蛋白质/g菌球; 10 mg/L Cd2+实验组中含量为0.56 mg蛋白质/g菌球; 100 mg/L Cd2+实验组中含量仅为0.22 mg蛋白质/g菌球,这说明Cd2+浓度越高,蛋白质含量整体越低。 由图2b可知,在黄孢原毛平革菌培养5 d后,100 mg/L Cd2+实验组中含量为20.00 mg多糖/g菌球; 10 mg/L Cd2+实验组中含量仅为12.16 mg多糖/g菌球; 对照组中含量最高为26.64 mg多糖/g菌球,这说明Cd2+浓度越高,EPS中多糖含量整体越高,但实验组中多糖含量均要低于空白组。 这表明镉胁迫会影响黄孢原毛平革菌EPS中组分的含量。 在1～100 mg/L范围内,镉胁迫浓度越高,单位干重菌球的EPS中蛋白质含量越低,而多糖含量越高。

图2 不同培养时间的单位干重菌球的EPS组分含量变化Fig.2 Changes in EPS composition of unit dry weight of Phanerocheate chrysosporium at different culture times

2.3 EPS与镉去除量的相关性

分别对镉胁迫下EPS中多糖、蛋白质含量与镉去除量进行线性拟合(图3)。

由图3a可知,EPS中蛋白质含量与镉去除量之间呈现负相关,且线性关系一般;由图3b可知,

图3 EPS组分含量与镉去除量的拟合Fig.3 Correlation fitting between EPS component content and Cd removal amount

EPS中多糖含量与镉去除量之间呈现正相关,且线性关系良好。 多糖含量与镉去除量之间的相关性强于蛋白质含量与镉去除量之间的相关性,这表明在EPS去除镉的过程中， 多糖发挥的作用较蛋白质更大。 Cd2+初始浓度越大,诱导菌体分泌更多多糖(图2),多糖中羟基羧基在EPS去除镉过程中起关键作用[15]。此外，在被黄孢原毛平革菌去除的过程中Cd2+的形态可能会发生变化。黄孢原毛平革菌会产生有机酸,如草酸会螯合Cd2+形成草酸镉沉淀,菌体表面EPS中多糖有粘性,能粘附沉淀达到去除镉的效果,因而Cd2+诱导菌体EPS组分产生的变化有助于去除更多的镉[16]。

2.4 SEM及EDS分析

对100 mg/L Cd2+实验组获取的菌球进行SEM形貌观察发现提取EPS前、后菌丝体形态未出现明显变化(图4)。使用EDS能谱分析菌体表面元素组成,结果见表1。菌体经提取EPS后,其表面成分中镉含量从5.14%下降到4.42%,进一步证明了EPS在镉去除过程中发挥着一定的作用。同时也说明菌体表面还存在其他去除镉的方式,如重金属离子在细胞壁表面形成络合物、细胞壁与重金属离子的交换等[17-19],因此去除EPS后菌体表面仍能检测到镉。

图4 100 mg/L Cd2+胁迫下菌体扫描电镜Fig.4 SEM images of Phanerocheate chrysosporium under the stress of 100 mg/L Cd2+

表1 100 mg/L Cd2+实验组菌体微区成分及含量

Table 1 Composition and mass fraction of microzone in 100 mg/L Cd2+experimental groupwB/%

菌体类型OPSKFeCd 未提取EPS35.3115.731.7811.4328.015.14 已提取EPS37.8117.673.0310.1123.034.42

3 结 论

采用白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌进行镉的去除试验，得到以下结论：

(1)EPS在黄孢原毛平革菌去除镉初期发挥着更重要的作用,且在低浓度镉的去除过程中作用更大。

(2)镉胁迫会影响黄孢原毛平革菌EPS中组分的含量。 Cd2+在1～100 mg/L范围内,镉胁迫浓度越高,单位干重菌球的EPS中蛋白质含量越低,而多糖含量越高。

(3)多糖含量与EPS中镉去除量之间的相关性明显强于蛋白质含量与EPS中镉去除量之间的相关性,说明在EPS去除镉的过程中多糖发挥的作用相较于蛋白质更大。

(4)提取EPS后的菌球表面微区成分中镉含量下降,证明了EPS在镉去除过程中发挥着一定的作用。