microRNA-24作为急性动脉粥样硬化性脑梗死进展的生物标志物研究

袁 磊 赵晓玲 王 明 刘 洋 鹿滨麒 黄鹂丽

河南省南阳市第二人民医院神经内科 473000

脑梗死是一种主要的脑血管疾病，威胁着人类的健康和生命，具有高发病率、致残率和死亡率[1]。找到有效的生物标志物用于急性动脉粥样硬化性脑梗死进展的早期诊断至关重要。血清生物标志物的使用被认为是常规临床检查和影像数据的最有价值的辅助手段。既往研究证明炎症标记物，如hs-CRP和IL-6与脑梗死进展相关。

miRNA是一类天然存在的非编码短RNA，可以调节基因的表达，并发挥各种重要的生物学功能，包括细胞分化、发育、免疫应答、代谢和癌变。此前的研究表明miRNA在啮齿动物脑梗死血液和脑细胞中表达失调[2]。有几种miRNA，包括miR-24，miR-210和miR-223等被报道作为脑梗死的生物标志物。microRNA-24 (miR-24), 其序列为5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’，是一种内源性非编码小RNA，其表达失调能否对急性动脉粥样硬化性脑梗死(PCI)进展风险进行预测，或风险预测是否可靠，需要进一步的研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究为前瞻性研究。选取2018年6月—2019年5月我院神经内科收治的急性动脉粥样硬化性脑梗死患者194例，根据有无脑梗死进展分为进展组60例和对照组134例。纳入标准：(1)发病24h内就诊；(2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》中急性动脉粥样硬化性脑梗死的诊断标准[3]；(3)经头颅MRA或CTA证实病因为动脉粥样硬化。进展型脑梗死的诊断标准: 1周内NIHSS评分增加≥2分[3]。排除标准：(1)伴有意识障碍者；(2)存在心功能衰竭、心房颤动、风湿性心脏病等严重心脏疾病者。本研究经我院伦理委员会根据“赫尔辛基宣言—人体医学研究伦理原则”批准。所有患者均提供书面知情同意书。

1.2 数据收集 收集两组患者的基线特征、常见脑梗死高危因素。

1.3 RNA分离和定量实时PCR 在脑梗死发病24h内，在不添加凝血剂的情况下，将5ml静脉血收集到血清分离管中。使血液自然凝结并以1 600转/min离心5min。收集等份的血清立即冷冻，并储存在-80℃直至分析。

根据制造商的推荐，使用Trizol Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分离总RNA。A260nm/A280nm比率为1.9和28S/18S比率为1.8是后续PCR的最低要求。用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)逆转录总RNA(2μg)。Taqman定量RT-PCR用于miRNA特异性引物扩增(目录号4427975；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。将反应物在96孔光学板中于95℃温育5min，然后在95℃下进行40个循环15s和60℃下1min。在StepOne Plus实时PCR仪(Applied Biosystems)上进行PCR反应，并使用2-ΔΔCT方法计算相对表达。U6(small nuclear RNA，snRNA6)用作内部参照。

1.4 血清hsCRP和血清IL-6的浓度 检测脑梗死发病后24h内血清hs-CRP水平。使用夹心酶联免疫吸附(ExCell，Shanghai，China)测定血清IL-6水平，并且所有测定一式两份进行。

1.5 统计学方法 使用SPSS20.0统计进行数据分析。符合正态分布的计量资料使用t检验进行分析。计数资料组间比较采用χ2检验。不符合正态分布的计量资料，使用Kruscal-Wallis和Mann-WhitneyU检验或Wilcoxon Signed Rank检验进行分析。通过接受者操作特征ROC曲线分析血清miRNA-24作为急性动脉粥样硬化性脑梗死进展的预测价值。用Spearman试验进行相关性分析。双侧P<0.05被认为存在统计学显著差异。

2 结果

2.1 临床基线资料比较 进展组糖尿病比例及同型半胱氨酸高于对照组(P<0.05)，两组其他患者基线特征及常见脑梗死高危因素比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 两组的血清miRNA-24和血清hsCRP，IL-6水平 进展组和对照组分别测定血清hs-CRP和血清IL-6。进展组与对照组比较，hs-CRP(图1A)和血清IL-6(图1B)显著上调。进展组与对照组进行比较，血清中miR-24同样显著上调(图1C)。越来越多的证据表明，循环miR-24可能成为急性动脉粥样硬化性脑梗死进展的生物标志物。

2.3 血清miR-24与促炎标志物的相关性 研究结果显示，血清miR-24表达和血清hs-CRP(r=0.523 1)(图2A)，或IL-6(r=0.530 5)(图2B)之间存在中度正相关。

表1 进展组和对照组基线临床特征

图1 进展组和对照组血清hs-CRP、IL-6及miR-24水平

2.4 血清miR-24与梗死体积、NIHSS评分的相关性 据报道血清hs-CRP水平升高与梗死体积、NIHSS评分呈正相关，本文目的是验证血清miR-24的表达能否反映急性动脉粥样硬化性脑梗死的严重程度，能否作为脑梗死进展预测结果的临床工具。本文结果发现血清miR-24的表达与梗死体积(r= 0.519 9，图3A)和NIHSS评分(r= 0.646 0，图3C)均呈正相关。此外，我们根据梗死体积(>3cm3)

图2 血清miR-24的表达与PCI患者血清hs-CRP和IL-6相关性

或NIHSS评分(>5)将患者分为两组，本文结果发现梗死体积>3cm3(P<0.001，图3B)或NIHSS评分>5(P<0.001，图3D)患者血清miR-24水平显著增加，这表明的miR-24水平较高可能代表急性动脉粥样硬化性脑梗死病情较重，易发生进展。

图3 血清miR-24的表达与梗死体积、NIHSS评分相关性

A & C：使用Spearman方法确定相关性。B：条形表示中位数和四分位数范围。Mann-WhitneyU检验用于统计分析。D：条形表示中位数和四分位数范围。Wilcoxon符号秩检验用于统计分析

2.5 血清hs-CRP、IL-6和血清miR-24联合用于预测PCI 通过血清miR-24预测PCI的ROC曲线下面积(AUC)为0.776(95%CI:0.628～0.813，P<0.001),见图4。为了进一步评估失调的miR-24的预测值，计算hs-CRP、IL-6和miR-24组合的ROC曲线。如表2所示，hs-CRP和miR-24的组合获得了更高的灵敏度/特异性(AUC=0.863,95%CI:0.801～0.936，P<0.001)，比单独的血清hs-CRP高10.4%。IL-6和miR-24的组合获得了更高的灵敏度/特异性(AUC=0.819,95%CI:0.738～0.892，P<0.001)，其比单独的血清IL-6高19.7%。此外，hs-CRP、IL-6和miR-24的组合获得最高的敏感性/特异性(AUC=0.866,95%CI:0.802～0.925，P<0.001)，这与 hs-CRP和miR-24组合非常相似。

图4 miR-24预测PCI的ROC曲线

表2 miR-24的ROC值

3 讨论

最近研究发现循环miRNA是稳定的、可再生的，并且已经被提出作为诊断许多神经退行性疾病新的非侵入性生物标志物[4]。有研究表明，许多循环miRNA与神经血管完整性、功能障碍和卒中介导的炎症相关[5-6]。尽管已报道许多循环miRNA与PCI相关，但是这些失调的miRNA是否对于PCI风险预测是可靠的，需要多研究人员进一步验证。

miR-24是研究最多的miR之一，其在血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMCs)的增殖、分化和表型转换中至关重要。在心血管系统，miR-24不仅对心脏和血管的细胞分化、增殖很重要，并已被认为是血管疾病治疗的新靶点[7-8]。炎症标记物例如血清hs-CRP和IL-6在PCI被用作附加的诊断工具，因此，本研究评估了表达失调的循环miR-24和脑梗死进展、hs-CRP或IL-6的相关性。结果表明，血清miR-24与脑梗死进展及血清hs-CRP或IL-6呈正相关，可作为PCI的潜在生物标志物。此外，血清miR-24与梗死体积和NIHSS评分呈强阳性相关。因此，血清的miR-24也可以反映急性动脉粥样硬化性脑梗死的严重程度，可能用作预测脑梗死进展的临床工具。

为了提高诊断的灵敏度和特异性，总是使用多种生物标志物的组合。hs-CRP和D-二聚体的组合提高了急性期心源性栓塞的诊断准确性。较高的hs-CRP水平和脂蛋白相关的磷脂酶A2(lipoprotein-related phospholipase A2，Lp-PLA2)活性与急性动脉粥样硬化性脑梗死更严重的神经损伤和更大的梗死面积显著相关[9]。hs-CRP和同型半胱氨酸是急性动脉粥样硬化性脑梗死进展预后和死亡率的独立预测因子[10]。组合模型可以提供更可靠的预后评估。在本研究中，hs-CRP和miR-24的组合获得了更高的灵敏度/特异性(AUC=0.863，P<0.001)，比单独的血清hs-CRP高10.4%，而hs-CRP、miR-24和IL-6的组合获得了非常相似的灵敏度/特异性(AUC=0.866，P<0.001)。因此，miR-24可能是PCI预测的潜在生物标志物。

本文结果不仅为miR-24作为PCI评估的新生物标志物提供了证据，而且进一步证实了miR-24在血管病理学中的重要作用。很多脑梗死发生、发展中的细胞变化都是由miRNA表达变化介导的，这表明miRNA表达的分析可以提高对脑梗死发病机制的认识，并发现脑梗死进展风险评估和治疗的新途径。血清miR-24升高是评估急性动脉粥样硬化性脑梗死进展的潜在生物标志物。

本研究也存在一些局限性：首先，由于本研究的单中心和病例数较少，可能存在由未测量因素造成的残余混杂；其次，该研究随访时间较短。将来需要大规模的随机、对照试验提供长期的临床分析。