降胆固醇益生菌对马铃薯酸奶发酵的影响与品质分析

郑 佳，何腊平，陈翠翠，刘涵玉，陶 菡

（贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

酸奶由于富含功能菌、成分易消化而深受消费者喜爱[1]。不过当前市场上的酸奶品种偏少，未能完全满足人们对高品质酸奶的需求。影响酸奶品质的主要因素有原料、菌株及发酵工艺参数。原料奶在发酵前需要补充糖分，而糖分一般是由淀粉质原料糖化制得。马铃薯是仅次于小麦、水稻、玉米之后的第4大粮食作物[2]，淀粉含量约10%以上，我国规划有把马铃薯作为主粮的战略。目前，马铃薯深加工还很欠缺，鉴于马铃薯富含糖少蛋白[3]，而牛奶含有丰富的蛋白质[4]，可将马铃薯与牛奶搭配组成全价营养食品。现有报道马铃薯酸奶相关产品，为避免马铃薯中龙葵素带来的涩味，多用马铃薯汁或全粉混合发酵[5]，而选用鲜薯无疑可增加其营养成分。因此，本实验采用新鲜马铃薯作为原材料，糖化后与牛奶适当复配发酵酸奶。

酸奶发酵另一个关键因素是菌株[6]，直接影响酸奶发酵的风味和质地与功能成分[7]。但是，我国产业化应用与酸奶发酵的有自主知识产权的菌株还很少。基于此，本课题组前期筛选出了4 株有自主知识产权的降胆固醇优良动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）BZ11[8]和BZ25[9]、类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）SQ-4[10]、戊糖乳杆菌（L. pentosus）MT-4[10]，并在进一步推广其产业化应用方面进行基础研究。

心脑血管疾病是健康的第一杀手，同时血清胆固醇含量过高是心脑血管疾病的一个重要原因[11]，研究表明降胆固醇益生菌补充剂能够提供一种新的非药理学替代方法降低心血管危险因素[12-13]。乙醛及双乙酰是酸奶发酵过程中产生的主要风味物质[14-15]，但目前鲜见菌株对主要风味物质乙醛及双乙酰的影响研究，也鲜见降胆固醇菌株复配用于发酵乳制品的报道，需进一步完善和探索。

本研究主要对马铃薯鲜薯进行适当前处理，以将龙葵素去除到口感无涩味或涩味很弱，然后适当添加到牛奶中作酸奶发酵原料，课题组现具有自主知识产权的降胆固醇动物双歧杆菌乳亚种BZ11、BZ25和降胆固醇乳酸菌SQ-4、MT-4，及市场上常用的乳酸菌如嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）Q-1、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）BL1等中选择出合适发酵酸奶的菌株，探讨不同菌种及其适当组合对酸奶感官及乙醛、双乙酰两种风味物质的影响规律，并对产品进行理化性质分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

动物双歧杆菌乳亚种BZ11和BZ25、类植物乳杆菌SQ-4、戊糖乳杆菌MT-4为本实验室自筛的拥有知识产权的优良菌株。菌株BZ11和BZ25保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为：CGMCC NO.10224和CGMCC NO.10225；菌株MT-4和SQ-4保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC M 2016001及CCTCC M 2016002。

长双歧杆菌BL1筛选自双歧杆菌三联活菌片；动物双歧杆菌乳亚种BB12筛选自丹麦科汉森相关婴儿乳制品；嗜热链球菌Q-1筛选自天友酸奶。

1.1.2 试剂与培养基

伊利脱脂乳粉、鲜马铃薯、某品牌酸奶（与实验室制作酸奶同一生产日期） 市售；双乙酰（化学纯）上海Solarbio生物科技有限公司；邻苯二甲醛、邻苯二胺（均为化学纯） 国药集团化学试剂有限公司。

蛋白胨吐温酵母抽提物葡萄糖（peptone tween yeast extract glucose，PTYG）培养基[16]、MRS（De Man,Rogosa and Sharpe）培养基[17]、MC（modified Chalmers）培养基[17]。

1.2 仪器与设备

SPX恒温生化培养箱 上海恒科实业发展有限公司；SW-CJ-ID操净工作台 上海苏净实业有限公司；水套式二氧化碳培养箱 上海三腾仪器有限公司；pH计成都世纪方舟科技有限公司；1100高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 马铃薯糖化工艺

将马铃薯去皮，切块，浸泡30 min（除龙葵素到适度低量，以不感觉到涩味为准，保留适当低量的龙葵素对健康有益）后煮熟打浆，按0.2%加入耐高温淀粉酶，再加入0.8%的糖化酶，60 ℃水浴3 h至糖化完全，取出灭酶20 min。使得糖化液中马铃薯质量浓度为0.33 g/mL。

1.3.2 酸奶发酵

用马铃薯糖化液配制一定浓度脱脂乳粉复原乳，均质后于90 ℃灭菌10 min，将灭菌的复原乳冷却备用。确定糖化液中马铃薯质量浓度0.33 g/mL、乳粉质量分数12%、发酵温度37 ℃、加糖量1.5%。选取实验室现有的菌株BZ11、BZ25、BL1、BB12、MT-4、SQ-4和Q-1，按照一定的接种量接入所用菌种，发酵温度为37 ℃，一定时间后得到酸奶样品，4 ℃冰箱冷藏12 h后得到成品，以滴定酸度、pH值、色泽、滋味、气味、组织状态、酸甜度、凝乳时间、双乙酰、乙醛质量浓度为考察指标，考察单菌、复合菌、接种量、菌种比例对马铃薯酸奶发酵的影响。每次改变一个变量考察变量的影响规律，本次考察变量的最适值在后续考察中保持不变。

1.3.3 感官评定

酸奶感官分别从外观状态和风味2 个方面进行评定。采用描述性分析方法对酸奶进行外观描述并打分，同时对酸奶的风味协调性和风味强度进行评定并打分[18]，根据风味强度及协调性，选择乙醛及双乙酰质量浓度较合适的匹配度范围，之后以该匹配度确定变量水平。感官评定标准[19-20]见表1。

表1 酸奶感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of yogurt

1.3.4 酸奶指标测定

活菌数测定采用平板计数法；乙醛、双乙酰检测采用碘液滴定法及邻苯二胺比色法[21]；蛋白质测定参照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》；滴定酸度测定参照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》；持水力测定参考Hernández等[22]方法；微生物指标测定参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》及GB 19302—2010《发酵乳》。

1.3.5 游离氨基酸测定

采用邻苯二甲醛柱前衍生以相高效液相色谱-紫外检测法。将样品以5%（V/V）三氯乙酸溶液沉淀后上样，采用1100高效液相色谱系统，色谱柱为Agilent Hypersil ODS柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相A（pH 7.2）为7.35 mmo/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃（500∶0.12∶2.5，V/V），流动相B（pH 7.2）为7.35 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）；洗脱程序：0 min，8% B；0～17 min，8%～50% B；17～20.1 min，50%～100% B；20.1～24 min，100%～0% B。流动相流速1.0 mL/min；紫外检测器发射波长338 nm；脯氨酸检测波长262 nm；进样量1 μL；柱温40 ℃。氨基酸含量以外标法定量。

1.3.6 酸奶降胆固醇能力的测定

采用邻苯二甲醛比色法[23]检测菌种在酸奶中的降胆固醇作用。

1.4 统计分析

利用SPSS 19.0进行方差分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株对马铃薯酸奶感官及风味的影响

将实验室的4 株双歧杆菌与2 株乳杆菌分别做单菌株发酵及混菌发酵。混菌发酵从双歧杆菌中选择2 株，乳杆菌中选择1 株，糖化液马铃薯质量浓度0.33 g/mL，乳粉质量分数18%，接种量5%，37 ℃发酵，单菌株发酵时间为16 h，混合菌株发酵时间为13 h，得到其理化、感官及风味分析如表2所示。

表2 不同菌株发酵酸奶感官及风味分析Table 2 Sensory evaluation and flavor analysis of yogurts fermented with different strains

研究[24]表明乙醛质量浓度不小于5 mg/L时，才会产生明显的感官风味。且酸奶中的风味化合物并非越多越好，只有当不同的风味化合物达到平衡时，酸奶才呈现诱人的香味。有报道称酸奶的风味协调感与羰基化合物的含量和比例存在一定关系。Bottazzi等[25]认为在嗜热链球菌发酵的酸乳中，要想得到所需要的香气，双乙酰与乙醛质量浓度比值为1更为合适，也有研究认为当比例为0.62～1.09更好。本研究对比了其协调性及风味强度，发现乙醛与双乙酰的比值在1左右，其风味更好，且感官评分更高（≥70 分）。

由表2可知，不同菌种在发酵过程中产酸、凝乳及感官等存在菌种特异性。单菌株发酵中，乳杆菌较双歧杆菌凝乳快，可能是由于其生长速率较双歧杆菌快，产酸快。在发酵16 h后，单菌株发酵均达到凝乳状态，其中BZ11的综合感官评分更好，BL1发酵酸奶质地均匀紧密。复合菌株与单一菌株相比，凝乳时间均有很大程度提高，在混菌发酵中，产酸速率增加，pH值下降更快。各菌株间存在协同作用，复合发酵能缩短发酵时间，提高发酵速率[26]，BZ11、BL1、MT-4及Q-1组合无论是质地还是滋味气味，较其他组合更好。

实验表明双乙酰和乙醛含量与菌株特异性及其相互作用有很大关系，尤其菌株组合明显影响乙醛质量浓度。与现有报道一致，混菌发酵能明显提高酸奶产品乙醛及双乙酰质量浓度[27]。嗜热链球菌及乳酸菌发酵酸奶的两种风味物质含量高于双歧杆菌，属于产香优异的商业菌株，而乳酸菌在发酵过程中繁殖较双歧杆菌快，高浓度的活菌数更有利于风味物质的生成。

综合考虑，菌株对酸奶发酵有重要影响，自筛专利菌株BZ11及MT-4产酸及感官较好，BL1发酵酸奶质地较好，Q-1风味更好，所以选择BZ11、BL1、MT-4、Q-1这一组合考察后续的接种量和菌种比例对马铃薯酸奶的发酵的影响。调节各种子液浓度至5×108CFU/mL后接种，以其与原料体积比计算接种量及菌种比例。

2.2 接种量对马铃薯酸奶感官及风味的影响

合适的接种量可以延缓甚至消除延滞期，在较短的时间内获得最佳的产酸，得到感官更好的产品。以接种量为梯度，糖化液马铃薯质量浓度0.33 g/mL，乳粉质量分数12%，BZ11、BL1、MT-4、Q-1菌种比例1∶1∶1∶1，发酵时间13 h，检测接种量对酸奶感官品质的影响，结果见图1。

图1 接种量对马铃薯酸奶感官及风味的影响Fig. 1 Effect of inoculum size on sensory score and flavor components of potato incorporated yogurt

由图1可知，马铃薯酸奶感官评分随着接种量的增加呈现出先增大后减小的趋势，接种量越大，凝乳越快，得到的酸奶产品pH值越低。接种量小于3%，凝乳慢，质地较软，酸甜度不适宜；大于4%，发酵异味明显，酸味太重，且质地较硬，有少量乳清析出。因此3%及4%的接种量符合传统酸奶的感官要求。

随着接种量的增加，乙醛质量浓度出现波动，而双乙酰质量浓度一直在缓慢上升。接种量小于3%时，乙醛质量浓度随接种量的增加而增加，大于3%，呈降低趋势。目前认为，酸奶制作中乙醛的产生原因有糖酵解途径产生的丙酮酸分解、氨基酸转化分解以及DNA降解，双乙酰是在糖酵解途径及柠檬酸代谢途径产生的。接种量直接影响发酵初期的活菌浓度，在低接种量下，菌株大都处于生长期，是代谢产物逐渐积累的过程，随着接种量的增加，会产生大量的风味前体物质，从而导致乙醛及双乙酰质量浓度增加。而接种量过高，初始活菌浓度高，菌株生长快，同时衰亡菌株增加，属于发酵后期，乙醛通过乙醇脱氢酶系的作用向乙醇、乙酸及酯类转变[28]。双乙酰质量浓度在增加接种量时处于缓慢积累，后趋于平稳的状态，而其风味协调性在接种量4%及5%最为合适。综上所述，4%接种量使得接种后酸奶菌种的初始浓度保持在2×107CFU/mL，最有利于感官及风味。

2.3 菌种比例对马铃薯酸奶感官及风味的影响

接种后，随着发酵的开始，菌株进入延滞期，延滞期的长短影响菌株的生长及产酸[29]，且不同菌种之间存在相互作用，形成其独特的生长模式，选择适宜的菌种比例能更好地控制发酵过程。以菌种比例（11-1-M-Q）为梯度，糖化液马铃薯质量浓度0.33 g/mL，乳粉质量分数12%，接种量4%，发酵时间13 h，调节4 株种子液浓度至5×108CFU/mL，检测菌种比例对马铃薯酸奶感官品质的影响。

图2 菌种比例对马铃薯酸奶感官及风味的影响Fig. 2 Effect of ratio among four selected strains on sensory score and flavor components of potato incorporated yogurt

由图2可以看出，菌种比例对马铃薯酸奶产品的感官评分有很大影响，研究发现适当增加Q-1的比例，能获得风味更好的产品，MT-4的比例过高，会加快产酸，引起酸奶出现涩味及乳清析出等不良现象。各个菌株对色泽的影响较小，主要影响酸甜度、组织状态、气味及滋味。当BZ11、BL1、MT-4、Q-1的比例为1∶1∶1∶2时，得到的产品酸甜适宜，凝乳质地较好，且口感细腻绵绸。

对比不同比例下乙醛及双乙酰的含量差异，图2显示，在各个比例中，产品双乙酰质量浓度的变化不明显，而菌种比例主要影响乙醛质量浓度的变化。增加Q-1的比例能不同程度增加乙醛的含量，但由于混菌发酵是菌株相互影响的过程，存在不同程度的协同作用，因此每个菌株对两种风味物质的影响不能一概而论。相比之下除2∶2∶1∶1比例外，其余菌株的风味协调性均较好，而1∶1∶1∶2比例下的乙醛及双乙酰质量浓度较高，且协调性同样不错。故选择1∶1∶1∶2作为其发酵菌菌种比例。

2.4 马铃薯酸奶的理化及微生物水平

除感官评价外，马铃薯酸奶的理化性质及微生物水平能更全面地以映产品整体品质。以研究得到的最优菌种比例组合及最适接种量发酵酸奶产品，对比其与市售酸奶理化品质上的差异。

表3 马铃薯酸奶的理化品质Table 3 Physicochemical quality of potato incorporated yogurt

由表3可知，马铃薯酸奶理化指标符合国家标准，而且具有一些突出优点：益生菌马铃薯酸奶含糖量（1.94%）较低，未经调配就能达到与市售酸奶相同的质地口感，其蛋白质含量优于普通市售酸奶，游离氨基酸水平高，这些都是由于马铃薯除了提供糖类物质外，其糖化后剩余纤维素及果胶类物质还能增加黏稠度，提高质地水平。马铃薯酸奶与市售酸奶的主体风味物质有很大差别，马铃薯酸奶能带给产品独特的柑橘香及果香。

此外，检测到马铃薯酸奶的益生菌总活菌数为6.3×108CFU/mL，且其中双歧杆菌的数量达到3.6×108CFU/mL。活菌数越多，其在胃肠道定植的可能性越大。双歧杆菌作为胃肠道益生性最好的菌群，由于其生长缓慢及厌氧生长等原因，在食品中的应用受到限制，但本实验使用BZ11及BL1都有良好的耐氧特性，使酸奶成品的活菌数也达到较高浓度，满足益生菌发挥益生作用浓度需达到1×106CFU/mL的要求，对人体肠道菌群平衡起到预防和调节的作用。

2.5 马铃薯酸奶游离氨基酸分析

表4 马铃薯酸奶游离氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents of potato incorporated yogurt mg/100 g

酸奶的形成过程实际上是蛋白质变性凝固的过程，氨基酸作为蛋白质的组成部分，种类和含量是食品营养及风味的重要指标。其中，游离氨基酸含量主要参与风味物质的形成，而且其含量的多少也直接与蛋白质的水解程度和其被人体吸收利用的生物学效价呈正相关。表4中3 种样品均检测出17 种游离氨基酸，其中发酵前总游离氨基酸质量浓度为112.5 mg/100 g，是市售牛奶的3～5 倍，这与使用的原材料有关。马铃薯蛋白质含量虽较低，但它的加入在一定程度上增加了游离氨基酸水平，而且加热糖化过程、均质及灭菌过程会发生蛋白质变性，其共价键遭到破坏，导致游离氨基酸增加[30]。实验证明发酵后各游离氨基酸较发酵前有不同程度的升高，马铃薯酸奶的总游离氨基酸及必需氨基酸含量更高，其必需氨基酸百分比也更高。这是由于在发酵过程中部分蛋白质被微生物分解，形成小肽和氨基酸，这也大大提升了酸奶的生物学效价。

与市售酸奶相比，添加益生菌的马铃薯酸奶游离氨基酸含量更高，其中谷氨酸、精氨酸及丙氨酸含量较多。丙氨酸经氨基酸脱羧以应可以生成乙醛。精氨酸作为人体必需氨基酸，在发酵前有20.84 mg/100 g。据报道[31]，脱脂乳中的精氨酸含量相对较少，所以含量较高的精氨酸可能来自于马铃薯本身或者原料操作过程中的加热均质等步骤[30]。经过发酵过程，游离精氨酸含量进一步增加（41.14 mg/100 g），作为风味物质前体，它能较快的参与美拉德以应，生成香味物质。

天冬氨酸、缬氨酸及酪氨酸经过发酵过程含量下降。其中天冬氨酸是生物体其他氨基酸及嘌呤的合成前体，天冬氨酸的降低可能是转化生成其他氨基酸。缬氨酸属于支链氨基酸，在代谢过程中可能通过氨基酸转移酶生成酮类，进一步转化成醛醇类物质，产生与酸奶风味类似的水果及香甜味[32]。因此，菌种通过发酵过程参与游离氨基酸的转化，一定程度上影响发酵前后的风味主体。

2.6 酸奶的降胆固醇作用分析

图3 菌种对酸奶胆固醇的降解作用Fig. 3 Degradation percentage of cholesterol in yogurt by pure and mixed cultures of four strains

由图3可知，在接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵时间16 h、乳粉18%、白砂糖0%、糖化液马铃薯质量浓度0.33 g/mL条件下，单菌株发酵都能不同程度降低酸奶中的胆固醇，而适当组合后，在接种量4%、发酵温度37 ℃、发酵时间12.5 h、乳粉12%、白砂糖1.5%、糖化液马铃薯质量浓度0.33 g/mL条件下，菌株BZ11、BL1、MT-4及Q-1混合发酵对酸奶中的胆固醇降解率达到20.43%，较单菌株增加1.86%～15.57%。对比前后酸奶中的菌株的降胆固醇情况，发现混菌发酵会增加菌株的降胆固醇能力，其原因可能是由于混菌对降胆固醇具有协同作用。斯日古楞[33]用1 株嗜酸乳杆菌代替传统酸奶发酵剂中的保加利亚乳杆菌，在发酵酸奶过程中对牛奶中胆固醇的降解率达14.3%。因此可以看出，酸奶的降胆固醇作用与菌株自身有很大关系。

3 结 论

菌株是酸奶发酵的核心，研究发现不同菌株菌株、接种量及菌种比例影响马铃薯酸奶的感官及其风味，适宜发酵酸奶菌株为BZ11、BL1、MT-4、Q-1，接种量4%，菌种比例1∶1∶1∶2；混菌发酵菌株间互相影响风味物质的生成。对比益生菌马铃薯酸奶与市售酸奶的理化性质，发现马铃薯酸奶有更低的还原糖质量分数（1.94%）、更高的游离氨基酸含量和益生菌水平（6.3×108CFU/mL），尤其是双歧杆菌达到3.6×108CFU/mL，这些显著提高了酸奶的营养价值。体外降胆固醇实验表明混菌发酵酸奶胆固醇降解率达到20.43%，较单菌株发酵酸奶提高1.86%～15.57%。通过本研究，找到了适合马铃薯酸奶发酵的组合菌株，且自筛的有自主知识产权菌株BZ11和MT-4表现出了一些优于商业菌株的优良特性。