基于特征图谱分析百合饮片、汤剂、中间体、颗粒相关性

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

药用百合，始载于《神农本草经》，为百合科植物卷丹、百合或细叶百合的干燥肉质鳞叶[1]。江苏宜兴、湖南邵阳、甘肃兰州和浙江湖州栽培百合历史悠久，为全国“四大百合产区”[2]。百合配方颗粒由百合饮片在中医药理论指导下，利用现代制药技术，经提取、浓缩、干燥、制粒和包装等精制而成，其功能、主治、性味、归经与传统百合饮片一致。由于配方颗粒缺少了传统饮片赖以判别优劣的外形、气味等性状特征，为保证其颗粒的质量，规定通过特征图谱的方式进行不同环节之间的鉴别。李敏等[3]对中药白芍亲缘性进行分析并对分子进行鉴定标记，为其他中药材品种的分子水平的鉴定研究提供了参考。以药材(饮片)、水煎剂、配方颗粒的相关性为基础的特征图谱研究可以准确地表达其特征的追溯性[4]。周永妍等[5]对独脚金配方颗粒、水煎剂、饮片特征图谱进行了比较研究，为全面控制独脚金配方颗粒的质量提供了方法；陈洁等[6]利用HPLC指纹图谱结合主成分分析对不同产地头顶一颗珠进行了质量评价；孙福仁等[7]基于UPLC特征图谱与主成分分析对白芷配方颗粒进行了质量评价。郭秋平[8]对不同来源药用百合及其总皂苷建立相关HPLC指纹图谱，并综合建立3 种不同来源药用百合共同的特征图谱，经相似度比较，得出药用百合总皂苷来源均一，质量稳定。蔡宝昌等[9]构建百合药材低极性部位的GC/MS指纹图谱，比较不同产地、不同品种百合中脂溶性成分的整体相似性，结果显示药用百合的整体相似度较食用百合高，且同一产区的样品相似度较高。聚类分析指将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程。王万良等[10]研究的聚类算法基于ADAM拉普拉斯约束，有更高的聚类效果和更快的运行效率，综合性能优于相关的聚类方法。陆亿红等[11]研究的基于区间数的不确定数据流的聚类算法，具有良好的聚类效果，提高了不确定数据流聚类的聚类质量和速率。

本研究采用HPLC法建立了百合配方颗粒的特征图谱，并考察标准汤剂与饮片、中间体、配方颗粒之间的相关性，旨在用于百合配方颗粒生产过程各环节的质量控制，也可为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性研究提供参照。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent 科技有限公司)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent 科技有限公司)，电子天平(YP502N，上海菁海仪器有限公司)，万分之一电子天平(BS124，赛多利斯科学仪器北京有限公司)，电子煎药壶(FT-30系列，深圳市正云科技有限公司)，旋转蒸发仪(R210+V700，瑞士Buchi公司)，德国eppendor小型离心机(Centrifuge mini)，PD-1D-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，循环水式真空泵(SHZ-D，巩义市予华仪器有限责任公司)，数控超声波清洗器(KQ-250DE，巩义市予华仪器有限公司)，干法制粒机(GZL100-25L，石家庄科源机械设备有限公司)。

1.2 实验材料

10 批百合饮片(表1)，10 批标准汤剂(自制)，10 批喷干粉(自制)，10 批配方颗粒(自制)。乙腈(色谱纯，TEDIA)，甲酸(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，纯水(杭州娃哈哈有限公司)。

表1 10 批百合饮片产地信息Table 1 Origin information of 10 batches of Lily slices

2 实验方法与结果

2.1 百合饮片供试品溶液的制备

取百合饮片粉末约1 g，加纯水50 mL，加热回流45 min(沸腾后计时)，取适量药液离心，13 000 r/min离心5 min，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 百合标准汤剂的制备

采用电子煎药壶煎煮，取百合饮片100 g，加8倍水浸泡30 min，加热沸腾后先武火煎煮30 min，后改文火煎煮30 min，趁热过120 目筛网，药渣再加6倍水，加热沸腾后武火煎煮30 min，趁热过滤，合并两次药液，得400～600 mL，即百合标准汤剂。

2.3 百合配方颗粒的制备

按2.2项下制得的百合标准汤剂减压浓缩，60～65 ℃，真空度-0.08 MPa，浓缩到相对密度(相对于纯水)为1.05～1.08 (25 ℃)，以浸膏不粘壁，流动性好为宜，得清膏。清膏喷雾干燥，进风温度180～185 ℃，出风温度85～90 ℃，得浸膏粉(即中间体)。浸膏粉加适量辅料干法制粒。

2.4 色谱条件

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水为流动相B，梯度洗脱按表2进行，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm。

表2 梯度表Table 2 Gradient table

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察

取百合标准汤剂1.5 mL，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取同一份供试品溶液20 μL，依照上述色谱条件连续进样6 次，结果见表3。结果表明：笔者方法共有峰的相对保留时间RSD均不大于0.06%，相对峰面积RSD均不大于0.75%，精密度良好。

表3 精密度考察结果(峰面积)Table 3 Precision test results (peak area)

2.5.2 重复性考察

取百合标准汤剂1.5 mL，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，依照上述色谱条件进样，结果见表4。结果表明：笔者方法共有峰的相对保留时间RSD均不大于0.09%，相对峰面积RSD除3号峰为7.13%外，均不大于1.32%，重现性良好。

表4 重复性考察结果(峰面积)Table 4 Repeated results (peak area)

2.5.3 稳定性考察

取百合标准汤剂1.5 mL，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，分别在0，2，4，8，12，24 h进样，结果见表5。结果表明：笔者方法共有峰的相对峰面积RSD均不大于3.71%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表5 稳定性考察结果(峰面积)Table 5 Stability results (peak area)

2.6 百合标准汤剂、中间体、颗粒的特征图谱

按照2.4项下的色谱条件，分别得到10 批百合标准汤剂、中间体、颗粒的特征图谱，如图1所示。

图1 百合不同阶段的特征图谱Fig.1 Characteristic maps of Lily at different stages

2.7 色谱条件选择

205，230，280，320，268 nm等多波长测试结果显示280 nm下峰的信息量较多，峰型及分离度较好，因此选择280 nm作为百合指纹图谱的检测波长。分别考察了0.8，1.0，1.2 mL/min 3 个流速对出峰时间和峰面积的影响，结果显示：流速对特征峰的出峰时间和峰面积有影响，流速1.2 mL/min时各特征峰峰面积均较小，流速1.0 mL/min较流速0.8 mL/min特征峰出峰时间快，故选择流速为1.0 mL/min。同时也考察不同仪器的耐用性，安捷伦1290 UHPLC、安捷伦1260 HPLC、安捷伦1290 UHPLC、安捷伦1260 HPLC在45 min内均能完成各特征峰的分析，但安捷伦1290 UHPLC色谱图中4号峰、5号峰峰面积较高，故选择安捷伦1290 UHPLC进行百合标准汤剂特征图谱分析较合适。

2.8 数据处理

2.8.1 10 批百合饮片的主成分分析

以5 个特征峰面积为统计数据，SPSS 12.0为统计工具，进行主成分分析。结果发现第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的累积方差贡献率可达98.02%，至第3主成分(PC3)的累积贡献率达到99.57%，说明前3 个主成分基本包含了5 个峰变量的全部信息。其中，前两个主成分得分最高的是峰1、峰2、峰4，说明这3 个峰对药材质量的影响最大。对PC1和PC2的得分向量作图，结果见图2，发现10批药材都在一组，说明本研究中所用到的各个产地的百合药材在主要化学成分上无较大区别，质量均一。

图2 百合饮片特征图谱主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of the characteristic map of Lily pieces

2.8.2 特征图谱的相关性分析

采集百合饮片、标准汤剂、中间体及配方颗粒的特征图谱进行叠加比较分析，可观察从原料到成品的化学成分变化，同时采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版”进行相似度计算，以标准汤剂共有模式为参照图谱，多点校正后进行Mark峰匹配。饮片、标准汤剂、中间体及配方颗粒的特征图谱的叠加效果如图3所示，可知百合饮片的5 个特征共有峰在标准汤剂、中间体、颗粒的色谱图中均可找到对应峰，说明配方颗粒的主要化学成分可追溯。

图3 特征图谱叠加图Fig.3 Characteristic atlas overlay map

3 结 论

笔者采用特征图谱技术结合主成分分析，对10 批不同产地的百合饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒进行了分析和评价。配方颗粒没有传统饮片赖以判别优劣的外形、气味等性状特征，无法通过传统方法判别优劣，本研究可以一定程度上确保其与传统饮片水煎剂的一致性。同时，笔者建立的特征图谱方法适用于百合配方颗粒的整个生产流程，为百合配方颗粒的质量控制提供了参考。研究表明：所拟定的百合配方颗粒特征图谱与百合饮片、标准汤剂特征图谱相似性高、化学成分基本一致，说明药材、标准汤剂和配方颗粒之间的化学成分可追溯，可用于百合配方颗粒的质量控制，也可用于生产过程各环节的质量控制。