H2O2氧化-荧光分析法测定乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量

陈露露，田颖刚,2*

1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047 2. 南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047

引 言

乌骨鸡(black-bone silky fowl, BSF) 作为我国特有的药食两用的资源，具有补肝肾、益气血, 尤其在增强体力、补血、治疗糖尿病和妇科疾病等方面效果显著[1]。与其他品种鸡相比，较显著差别在于乌骨鸡体内含有较多的黑色素。现代科学研究已证实黑色素具有抗氧化、抗衰老、抗诱变等众多生理功能[2]。

乌骨鸡黑色素是由黑色素细胞生成，且广泛分布于乌骨鸡许多组织和器官表面，如皮肤、肌肉、心脏、肾脏、消化器官和骨骼等。本实验室已建立了乌骨鸡黑色素细胞的培养体系[3]，这对于乌骨鸡黑色素的进一步研究具有重要意义。目前黑色素含量的测定方法有称重法[4]、色差仪比色法[5]、紫外-可见分光光度法[6]和高效液相色谱法(HPLC)等[7]。前两种方法可粗略地测定出黑色素含量，但在测定过程中可能会受到一些不溶于水的杂质的干扰[8]。研究证实，紫外分光光度法有一定的不足之处： (1)假阳性： 黑色素在测量过程中会出现散射和假吸收。(2)高背景： 黑色素样品中会有残留的蛋白，这些蛋白会使背景偏高，导致测量值较大。高效液相色谱法(HPLC)也用于黑色素定量测量，该方法灵敏度高、准确，主要通过测定黑色素的氧化产物PDCA和PTCA的含量来间接换算成样品中真黑色素的含量，但其操作复杂，成本较高[9-11]。

目前对于黑色素细胞中的黑色素含量的测定，主要采用NaOH裂解法[12-14]，该方法是将黑色素细胞在加热的NaOH中裂解，再采用酶标仪在400 nm左右测定其吸光值来定量细胞中黑色素的含量。由于该方法与紫外分光光度法的原理相同，都是采用朗伯-比尔定律，因此也存在和紫外分光光度法相同的缺点和不足，因此建立一种测定细胞中黑色素的含量的新方法显得至关重要。

荧光分析法是一种光学领域中用于荧光物质分析的常用方法。与传统方法相比，荧光检测方法具有线性范围宽、灵敏度高以及操作简单等优点。Fernandes等[10]证实黑色素在碱性过氧化氢溶液中的降解伴随着强荧光的产生，并且可用于定量测定体外培养黑色素瘤细胞中的黑色素含量，且黑色素氧化后的荧光信号不受蛋白质和脂质的影响，较吸收光谱法测定黑色素具有明显的优势。目前，尚未采用荧光分析法测定乌骨鸡黑色素细胞中含量。

本研究旨在建立一种荧光定量乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的新方法，并进行方法学验证，这将为乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的生成机理以及调控的进一步研究奠定了基础，也为测定其他更加复杂的生物组织中的黑色素含量提供了参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

乌骨鸡苗(5日龄)由江西泰和提供。胶原酶Ⅰ(Sigma公司)，DMEM培养基(北京索莱宝公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(北京博大泰克生物基因技术有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma 公司)，十四烷酰佛波醇乙酯(TPA，美国 Sigma公司)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，美国 Sigma公司)，过氧化氢(30%，50%)(分析纯)(广州西陇科学股份有限公司)，氢氧化钠(分析纯)(上海润捷化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F-4500荧光分光光度计，日本日立公司； Varioskan Flash 4.00.53全波长扫描式多功能读数仪，美国赛默飞世尔科技公司； INC153型细胞培养箱，德国memmert公司； DG5033A型酶标仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司； KQ-50超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司； Precisa XB220A电子天平，深圳市新朗普电子科技有限公司； 电热恒温水浴锅HH-4，上海森信实验仪器有限公司； 低速台式离心机80-2B，上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

1.3.1.1 乌骨鸡黑色素细胞培养

取乌骨鸡鸡苗，处死，3%Na2S脱毛，蒸馏水擦洗，浸没于75%乙醇中。在超净工作台取皮肤组织，置于培养皿中，用PBS漂洗两遍，并除去血块和肌肉等杂质。用0.25%氯霉素-青链霉素/PBS洗涤3次，每次5 min。PBS漂洗两遍后加入0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol·L-1EDTA置于37℃水浴消化90 min，10% FBS/DMEM完全培养基终止反应。400目无菌筛网过滤消化液，1 500 r·min-1离心5 min后收集细胞，按1×106个·mL-1的细胞浓度接种于25 cm2培养瓶中，加入10% FBS，10 ng·mL-1TPA，20 ng·mL-1bFGF，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞融合至90%～100%后进行传代。本文选用第3代进行后续实验。

1.3.1.2 A375细胞的培养

取培养至对数生长期的A375细胞，按4×105细胞个数接种于无菌培养瓶中，加入含10% FBS的DMEM，置于37 ℃，5% CO2恒温恒湿培养箱中培养。

1.3.2 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长的测定

制备乌骨鸡精制黑色素(本研究以精制黑色素为黑色素标准品)[15]，取浓度为100 μg·mL-1的乌骨鸡黑色素标准品0.5 mL于25 mL的锥形瓶中，加入终浓度为24%的过氧化氢溶液，使反应液体积达到2.5 mL，调节体系的pH值为8，避光，55 ℃孵育2 h，超声10 min，用蒸馏水定容到5 mL，混匀，3 500 r·min-1离心5 min，取上清，利用F-4500荧光分光光度计，在狭缝宽度5 nm、扫描速度为2 400 nm·min-1以及扫描间距为1 nm条件下对反应液进行荧光扫描，确定其最佳激发波长和发射波长。

1.3.3 标准曲线制作

分别配制质量浓度为10，20，40，60，80和100 μg·mL-1的乌骨鸡黑色素标准溶液，各取0.5 mL于25 mL的锥形瓶中，按照1.3.2的反应条件，取上清于全黑酶标板中，使用全波长扫描式多功能读数仪测定其相对荧光强度。

1.3.4 过氧化氢浓度对相对荧光强度的影响

取浓度为100 μg·mL-1的乌骨鸡黑色素标准品0.5 mL，加入终浓度分别为6%，10%，14%，18%，22%，24%和26%的过氧化氢溶液，其余氧化条件同1.3.2，测定其相对荧光强度，确定最佳过氧化氢浓度。

1.3.5 氧化时间对相对荧光强度的影响

取浓度为10和100 μg·mL-1的乌骨鸡黑色素标准品0.5 mL，加入终浓度为24%的过氧化氢溶液，分别孵育40，60，80，100，120和140 min，其余氧化条件同1.3.2，测定其相对荧光强度，确定最佳氧化时间。

1.3.6 pH值对相对荧光强度的影响

取浓度为10和100 μg·mL-1的乌骨鸡黑色素标准品0.5 mL，加入终浓度为24%的过氧化氢溶液，调节体系的pH值分别为6，7，8，9和10，其余氧化条件同1.3.2，测定其相对荧光强度，选择最佳pH值。

1.3.7 细胞中黑色素含量的测定

待细胞培养结束后，吸取细胞上清，PBS清洗1遍，加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol·L-1EDTA进行消化，含10% FBS的DMEM终止消化，收集细胞悬液，PBS清洗两遍，1 500 r·min-1离心5 min，细胞沉淀中加入0.5 mL的0.15 mol·L-1NaOH，80 ℃超声1 h，按照1.3.2的氧化条件进行反应，测定其相对荧光强度值。

1.3.8 方法检出限的测定与计算

按照1.3.3的测定方法，测定10份空白样品的相对荧光强度，采用紫外分光光度法[16]测定10份空白样品的吸光值，按照式(1)计算方法检出限[17-18]

Ck=3s/k

(1)

式中：Ck为方法检出限；s为空白的标准偏差；k为标准曲线斜率。

1.3.9 统计学分析

所得数据和图表的制作采用EXCEL(2019版)和Origin9.0软件进行处理，数据的统计分析采用SPSS17.0软件。数据均用均数±标准差(x±s)表示，多个样本之间比较用单因素的方差分析，两两比较采用LSD检验，检验水准α=0.05，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 乌骨鸡黑色素细胞形态

如图1所示，乌骨鸡黑色素细胞如其他黑色素细胞一样，胞内充满了黑色素颗粒，由于其生理状态不同，细胞中的黑色素含量也不同。由图可知，第1代黑色素细胞(a)中含有的黑色素含量显著高于第2代黑色素细胞(b)。

图1 乌骨鸡原代黑色素细胞形态(a)： 第1代乌骨鸡黑色素细胞； (b)： 第2代乌骨鸡黑色素细胞Fig.1 Morphological of primary melanocytesof Black-bone silky fowl(a): The first generation of BSF melanocytes;(b): The second generation of BSF melanocytes

2.2 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长

按照1.3.3测定方法，测定乌骨鸡黑色素标准品以及乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的荧光光谱。由图2和图3可知，激发光均在354 nm的荧光强度最大，发射光均在453 nm的荧光强度最大，因此乌骨鸡黑色素的激发波长为354 nm，发射波长为453 nm。

2.3 过氧化氢浓度对相对荧光强度的影响

如图4(a)所示，当过氧化氢的浓度范围在6%～24%之间时，相对荧光强度值随着过氧化氢浓度的增大而增大，当浓度达到24%时，相对荧光强度值开始趋于平稳，经统计学分析，过氧化氢浓度在24%时的相对荧光强度值显著高于22%(p<0.05)，与浓度为26%时的相对荧光强度无显著差异，这表明过氧化氢最佳浓度范围在24%～26%之间，本文选用24%为过氧化氢的工作浓度。

2.4 氧化时间对相对荧光强度的影响

当氧化时间在60～140 min的范围内，浓度为10和100 μg·mL-1的黑色素标准品的相对荧光强度如图4(b)所示，当黑色素标准品浓度为10 μg·mL-1时，氧化不同时间后所测得的相对荧光强度之间无显著差异，当黑色素标准品浓度为100 μg·mL-1时，相对荧光强度在120 min处最大，且显著大于100 min处的相对荧光强度值(p<0.01)，因此最佳氧化时间为120 min。

图2 乌骨鸡黑色素标准品激发光谱和发射光谱Fig.2 Excitation spectrum and emissionspectrum of the BSF standard

图3 乌骨鸡黑色素细胞中黑色素激发光谱和发射光谱Fig.3 Excitation spectrum and emission spectrumof melanin in BSF melanocyte

图4 各因素对相对荧光强度的影响Fig.4 Effect of various factors on the relative fluorescence intensity

2.5 pH值对相对荧光强度的影响

如图4(c)所示，黑色素标准品的浓度为10 μg·mL-1时，pH 8时的相对荧光强度显著大于其他pH值的相对荧光强度(p<0.01); 当黑色素标准品的浓度为100 μg·mL-1，pH值为8时的相对荧光强度最大，与pH值为9时的相对荧光强度并无显著性差异。综上所述，黑色素的氧化反应的最佳pH值为8。

2.6 线性回归分析及检测限

按照1.3.2的方法，得回归方程为b=0.014 7a+0.313 8(b为相对荧光强度，a为浓度)，r=0.997 4，线性范围在10～100 μg·mL-1，相关系数为正数，说明相对荧光强度随黑色素的含量增加而增加，并且它的绝对值接近1，成较好的正相关性。按照1.3.8的方法计算可得荧光分析法的方法检出限为0.30 μg·mL-1，紫外分光光度法的方法检出限为3.68 μg·mL-1，这表明荧光分析法的检测限较低，更适用于细胞内黑色素含量的测定。

2.7 精密度和重复性

精密量取细胞悬液，按照1.3.7的方法连续测定5次，其相对荧光强度值分别为0.93，0.97，0.96，0.97和0.95，RSD值为1.87%，表明仪器精密度良好。

精密量取3份相同的细胞悬液，按照1.3.7的方法分别测定，其相对荧光强度分别为0.93，1.00和0.93，RSD值为4.59%，表明其重复性较好。

2.8 加标回收实验

精密量取15份的A375细胞悬液，分成三组，每组加入浓度分别为25，40和80 μg·mL-1的黑色素标准溶液，按照1.3.7的方法测定其黑色素含量，每个加标水平平行测定5次，如表1所示，测得的黑色素含量分别为24.30，41.41和80.17 μg·mL-1，则相对误差分别为2.78%，3.53%和0.25%。

精密量取15份的黑色素细胞悬液，分成三组，每组分别加入质量为5.00，7.50和10.00 μg的黑色素，按照1.3.7的方法测定其黑色素含量，每个加标水平平行测定5次，计算回收率和平均回收率，见表2，回收率在95.94%～99.83%之间，平均回收率95.57%，RSD值为4.00%，表明该方法较准确。

表1 加标回收实验(人恶性黑色素瘤细胞)Table 1 Standard addition recovery experiment(A375)

表2 加标回收实验(乌骨鸡黑色素细胞)Table 2 Standard addition recovery experiment(the BSF melanocytes)

2.9 乌骨鸡黑色细胞中黑色素含量的测定

按照1.3.7的方法测定不同代数的乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的含量如表3所示，第1、2代的乌骨鸡黑色素细胞中的黑色素含量分别为7.06 μg/104个细胞、3.36 μg/104个细胞。这表明在体外培养的乌骨鸡黑色素细胞中，细胞中黑色素含量随着代数的升高有下降的趋势。

表3 乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量的测定Table 3 Determination of melanin contentin BSF melanocytes

采用NaOH裂解法测定细胞中的黑色素含量时，一些杂质与蛋白也会溶于NaOH中产生一定的吸收从而影响定量结果，使结果偏大[19]。本研究通过在A375细胞(无黑色素的人的黑色素瘤细胞)中添加不同浓度的黑色素标准品(25，40和80 μg·mL-1)，结果显示，测定值与理论值的相对误差分别为2.78%，3.53%和0.25%。这表明A375细胞中的其他杂蛋白以及脂质不会对黑色素氧化后产生的荧光有贡献。有研究已经证实，采用荧光分析法测定黑色素时，其他杂蛋白以及脂质对测定结果并无干扰[20]。为了进一步证实该方法的准确性，在乌骨鸡黑色素细胞中也分别添加了不同质量的乌骨鸡黑色素标准溶液，所得的回收率在92.14%～99.83%之间，平均回收率为95.97%，RSD值为4.00%，回收率较高，这表明该方法较准确可靠。黑色素溶解性较差，采用紫外分光光度法测定细胞中黑色素色的前提条件是黑色素需要完全溶解在碱液中，而荧光分析法在样品前处理过程中只需黑色素混悬在碱液中，简化了分析操作过程。并且通过比较可知，荧光分析法的方法检测限比紫外分光光度法低至少10倍。

综上所述，荧光分析法是一种简单、准确、检测限低，灵敏度较高的细胞中黑色素含量的测定方法，该方法的建立将为乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的生成机理以及调控的进一步研究奠定了基础，也为测定其他更加复杂的生物组织中的黑色素含量提供了参考。乌骨鸡黑色素氧化后荧光发射基团结构及荧光生成机理还有待于进一步研究。

3 结 论

建立了荧光定量乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的新方法，通过筛选得出乌骨鸡黑色素在10～100 μg·mL-1的浓度范围内的最佳氧化条件： pH值为8，氧化温度为55 ℃，过氧化氢浓度在24%～26%之间，氧化时间为2 h。该方法稳定、可靠，仪器精密度较高，重复性较好，且加标回收率较高，测定结果不受细胞中的杂蛋白以及脂质的影响，且准确可靠，成本较低、灵敏度高、检测限比紫外分光光度法低至少10倍、仪器操作简单，能够较好地应用于乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量的测定。该方法的首次建立将为乌骨鸡黑色素细胞中黑色素合成过程的调控以及乌骨鸡黑色素的深入开发利用奠定了坚实的基础，也为测定其他更加复杂的生物组织中的黑色素含量提供了参考。