蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠血清炎性因子的影响

王 蔚，杜 渊，王洪连，孙长侦，王 丽，白 雪，杨思进

（西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

脑出血是内科临床常见的危急重症，发病急，转变快，急性期严重威胁患者生命安全，患病后又往往留有不同程度的后遗症，给患者的生活质量造成不良影响，由此带来巨大的社会和家庭经济负担。研究表明，诸多炎性因子参与了脑出血的发病过程，且与疾病的预后密切相关［1-2］。脑出血属中医学“中风病”范畴，蛭龙活血通瘀胶囊是我院研制的院内中成药复方制剂，该药广泛用于中风患者的防治，取得了满意疗效［3］。本实验通过观察蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠脑组织病理形态和血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）及白细胞介素6（IL-6）的影响，探讨该药防治脑出血的有效作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量260～300 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物使用许可证号为SCXK（川）2015-030。饲养于西南医科大学实验动物研究中心，环境温度22±2℃，湿度30%～40%，普通大鼠饲料喂养，自由摄食及饮水。

1.2 药物 蛭龙活血通瘀胶囊由黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等药物组成，规格为每粒0.4 g（相当于含生药2.625 g），由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号20180216；盐酸法舒地尔注射液（规格为每支2 ml∶30 mg，批号180101，成都菀东药业有限公司生产）；TNF-α、IL-1及IL-6 ELISA检测试剂盒均为上海优选生物科技有限公司产品。

1.3 仪器 大鼠脑立体定位仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；ATPB457A小动物电子称（深圳安普特电子科技有限公司）；BSA224S精密电子天平；cx21FS1光学显微照相系统（日本Olympus公司）；国产BMZ-3型自动组织包埋机（湖北安立信医疗实业有限公司）；德国Leica石蜡切片机（北京科誉兴业科技发展有限公司）；infinite F50酶标仪（奥地利Tecan）；TDZ5-WS医用离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 分组与造模 将40只大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑出血模型组、蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组，每组10只。实验大鼠术前称重，按照0.4 g/kg给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪断鼠尾取自体血50µl。将大鼠以俯卧位固定于立体定位仪上，头部进行备皮消毒以暴露手术区域，纵行切开头皮正中约10 mm，用30%双氧水腐蚀骨膜，暴露前囟和冠状缝，参照ROSENBER［4］的方法，根据《脑立体定位图谱》［5］定位尾壳核区域，调整微量进样器使针尖垂直于矢状缝右侧旁开3.0 mm，前囟前0.2 mm处，用三棱针在针尖下方钻孔，深度达硬脑膜表面，以颅骨外板为零点进针6.0 mm，以5µl/min缓慢匀速将血注入脑内，留针约15 min后缓慢退针，骨蜡封闭钻孔，缝合头皮并常规消毒。假手术组术中只进针，不注血。采用ZEA LONGA 的“5分制法”［6］进行术后大鼠神经功能缺损评分，造模成功的大鼠（评分为1～3分）纳入实验。

2.2 给药 蛭龙活血通瘀组采用灌胃给药，每日1.2 g/kg（按成人60 kg用量为3.6 g/d计算，大鼠为人体用量20倍），灌胃体积为3 ml；盐酸法舒地尔组采用腹腔注射给药，每日12 mg/kg（按成人60 kg用量为90 mg/d计算）［7］；假手术组和脑出血模型组均给予等体积的生理盐水灌胃。

2.3 观察指标

2.3.1 脑组织病理形态 各组大鼠术后3 d给予深度麻醉，用0.9%生理盐水、4%多聚甲醛依次行心脏灌注，快速剪断鼠头，剥取大脑，冠状位切取针孔处含血肿的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定24 h后给予由低到高梯度的乙醇脱水，二甲苯透明，用石蜡包埋制成蜡块，用切片机切片，约为5µm厚度，展片、捞片、烤片，经二甲苯脱蜡，依次由高到低梯度乙醇浸泡，蒸馏水洗，苏木青染色后水洗，盐酸乙醇浸泡后水洗，弱氨水返蓝，伊红染色后水洗，再由低到高梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥后用中性树胶封片，在光学显微镜下观察血肿周围脑组织病理学改变。

2.3.2 血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量 各组大鼠术后3 d给予深度麻醉，仰卧位放在操作台上，剪开胸腔暴露心脏，用采血针经心脏采血3～5 ml于采血管中，静置2 h后，放入离心机，以3 000 r/min离心10 min，然后分离血清置于-20℃冰箱存放备检。采用酶联免疫吸附法（ELISA）对大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6进行检测，检测过程严格按照各试剂盒使用说明书的要求完成。

2.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件对数据进行分析，所有数据用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组血肿周围脑组织HE染色比较 假手术组：血肿周围脑组织结构清晰、完整，神经细胞胞体规律排列，胞浆染色均匀，无明显肿胀；脑出血模型组：血肿周围脑组织呈明显水肿，细胞核固缩，广泛液化，细胞间隙结构紊乱，血管周围的空隙增大，组织结构疏松，局部有出血，炎性细胞浸润及胶质细胞增生；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组和盐酸法舒地尔组的血肿周围脑组织水肿程度明显减轻，细胞层次也较清楚，神经细胞液化、坏死等均有所减轻，病理形态得到明显改善。见图1。

图1 各组血肿周围脑组织HE染色比较（×400）

3.2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比较 见表1。与假手术组比较，脑出血模型组大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与脑出血模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6的含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；蛭龙活血通瘀组和盐酸法舒地尔组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1及IL-6的含量比较 （pg/ml，x±s）

4 讨 论

脑出血后造成神经系统损伤和功能障碍的机制尚未完全明确，但血肿周围脑水肿形成是影响脑出血后病情转归和预后的关键环节，而炎性反应在其中产生了重要作用。喻明等［8］研究表明，脑出血后机体的适度炎性反应对血肿吸收和坏死组织清除具有一定的作用，而一旦炎性反应过度则会导致并加重脑水肿，影响出血区的脑血流量，增加血-脑脊液屏障通透性，使其结构破坏进而导致脑组织一系列继发性损伤。白细胞在病区局部聚集和黏附是炎性反应的重要标志，其中包括中性粒细胞的浸润，由此释放多种炎性因子，如TNF-α、IL-6等。这些由免疫细胞产生的小分子多肽具有很高的免疫活性，能介导调节免疫反应、机体代谢和炎性反应。研究证实，炎性因子在脑出血病理生理机制中具有重要作用［9］，在急性脑出血中能够激活、介导脑组织的继发性损伤。

炎性因子中TNF-α属于前炎性因子，是机体炎性反应和免疫应答的重要调节因子，中枢神经系统中由小胶质细胞及星形细胞分泌，通过激活血管内皮细胞，促进血管收缩，影响血-脑脊液屏障通透性，并可使小胶质细胞和星形胶质细胞变形肿胀，释放大量氧自由基及兴奋性氨基酸，与其他炎性因子如IL-1、IL-6协同作用，加重脑出血后脑水肿的发生［10］。IL-1是一类具有广泛作用的多肽，其与细胞膜上IL-1受体相结合，通过G蛋白发挥作用。在脑组织中，IL-1主要参与T和B淋巴细胞的增殖和分化，刺激造血干细胞分化，参与炎性反应,亦是多形核白细胞的直接及间接趋化因子，引起血肿周围聚集多形核细胞，炎症介质激活，诱导黏附分子合成及释放，使脑组织损伤加重。IL-6是一种分子量约为26 KD的细胞因子，在脑组织受到损伤时，可由小胶质细胞及星形胶质细胞诱导产生，同时周围血中分泌IL-6的白细胞数量也增多，从而使血清中IL-6含量升高，对中枢神经系统造成神经毒性作用［11］。研究报道，脑出血患者在起病后3～4 d血肿周围脑水肿的程度与起病24 h内TNF-α的含量相关，脑出血患者血浆中TNF-α与IL-6水平于发病后3 d达到高峰,这与脑组织水肿及炎性反应最严重的时期相吻合,并且随着病程的延长，脑水肿得到改善后TNF-α和IL-6的水平也有所下降［12-13］。

Ras同源基因/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase，Rho/ROCK）作为机体内广泛存在的一种信号传递通路，能够介导脑出血后炎症反应，影响血脑屏障通透性，与脑水肿密切相关，进而导致脑组织损伤。Rho激酶抑制剂通过抑制Rho激酶活性，可抑制炎性反应，抗血管痉挛及促进神经损伤后修复，具有神经保护作用，通过抑制该通路的激活，可抑制血管收缩和炎性因子的释放［14］。盐酸法舒地尔是一种新型的Rho激酶抑制剂，也是目前唯一一种应用于临床的Rho激酶抑制剂，研究显示，它可通过抑制磷酸化过程起到抑制炎性细胞迁移、浸润，减少炎症介质的产生，减轻炎症反应损伤，并可保护血-脑脊液屏障，减轻脑出血后脑水肿，促进脑损伤后神经功能修复［15-17］。动物实验证实，盐酸法舒地尔可降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平，减轻脑出血后的脑血管痉挛［18］。

蛭龙活血通瘀胶囊是我院常用的院内制剂，被广泛应用临床心脑血管疾病的治疗中，该药全方具有益气祛痰、活血化瘀、温经通络、养血祛风之效［19］。前期的动物实验表明［20-21］，该药能改善脑出血大鼠神经功能损伤评分，降低脑含水量，能明显抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）活化，促进蛋白酶激活受体-1（PAR-1）的表达，减少神经细胞凋亡，对脑出血大鼠具有脑保护作用。为进一步探索蛭龙活血通瘀胶囊防治脑出血的作用机制，本研究以自体血制备脑出血实验大鼠模型，以ROCK抑制剂盐酸法舒地尔为阳性对照药，观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后血清炎性因子TNF-α、IL-1及IL-6水平的影响。结果表明，蛭龙活血通瘀胶囊能明显改善脑出血大鼠脑组织病血肿周围病理形态，可能与显著降低脑出血大鼠血清TNF-α、IL-1及IL-6炎性因子的水平有关，但其机制是否与盐酸法舒地尔通过抑制ROCK通路调节炎性因子的释放相似，尚待进一步探索。