全反式维甲酸对大鼠肾间质纤维化的延缓作用及其可能分子机制▲

周添标 钟红珍 钟志青 谢伟基 翁文娟

(汕头大学医学院第二附属医院肾内科，广东省汕头市 515041，电子邮箱：zhoutb@aliyun.com)

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是导致终末期肾病的共同病理变化，目前其发生机制尚未完全明确，缺乏有效的治疗手段及药物[1]。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是维生素A的衍生物之一，其在体内通过维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)发挥作用，目前发现RAR有3种，分别是RARα、RARβ和RARγ[2]。阻抑素是一种抗增殖蛋白，目前发现其具有调控细胞分化及参与细胞线粒体呼吸链的作用及功能[3-4]。我们在前期研究中发现，阻抑素参与细胞外基质的积聚和RIF的发病过程，而ATRA可以通过调控阻抑素的表达而发挥抗RIF的作用[5-6]，但具体的作用机制尚不明确。本研究旨在探讨ATRA是否可通过RARα调控阻抑素表达，从而发挥延缓RIF进展的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 36只无特定病原体级雄性SD大鼠，6周龄，体质量120～150 g，购于汕头大学医学院实验动物中心[SCXK(粤)2017-0017]。所有大鼠常规喂养。

1.2 主要试剂及仪器 EliVisionTMplus广谱检测试剂盒购自福建迈新生物技术公司(批号：KIT-9902)；RARα、阻抑素、Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ,ColⅣ) 和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)抗体均购自美国Abcam公司(批号依次为ab28767、ab75766、ab236640、ab2413)；TRIzolTMLS Reagent试剂盒购自Invitrogen公司(货号：10296010)；反转录试剂盒购自TaKaRa公司(货号：RR047A)。Vectra成像分析系统购自美国PerkinElmer公司；ABI 7500型荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.3 RIF模型建立及干预方法 采用随机数字表法将大鼠分为ATRA组﹑RIF模型组和假手术组，每组12只。腹腔注射浓度为30 mL/L的水合氯醛(30 mL/kg)麻醉大鼠后，RIF模型组和ATRA组，在大鼠左背侧做长约3 cm左右的切口，然后暴露肾脏，使用棉签寻找并钝性分离左侧输尿管，在肾盏和肾下极处采用3-0丝线分别结扎输尿管，并离断输尿管，术毕缝合肌肉及皮肤；假手术组大鼠经水合氯醛麻醉后开腹只探及肾包膜。从术前第1天开始，ATRA组大鼠给予ATRA灌胃[15 mg/(kg·d)]，1次/d，其余两组大鼠采用等量生理盐水灌胃，直至处死。分别在造模后第2周末及第4周末，每组各处死6只大鼠，摘取左侧肾脏组织分成两份，其中一份采用100 ml/L的甲醛溶液固定用于病理及免疫组化检测，另一份于液氮中速冻后，置于-80℃冰箱中用于mRNA检测。

1.4 肾脏组织病理检查 采用常规石蜡包埋方法制作标本，切片厚3 μm，行Masson染色后，显微镜下观察肾脏组织的病理改变情况。随机选择肾间质区域20个视野(400倍)，计算RIF指数[7]，RIF指数(%)=(纤维化面积/肾小管间质总面积)×100%。

1.5 检测肾脏组织中RARα、阻抑素、ColⅣ和FN的蛋白表达 按照EliVisionTMplus广谱检测试剂盒说明书，采用免疫组织化学法进行检测[8]。石蜡切片放置在60℃温箱中烘烤3 h，采用二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后，使用自来水冲洗，磷酸缓冲盐溶液(0.1 mol/L)冲洗3次，3 min/次；采用柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L)对肾脏组织抗原进行高温高压修复10 min，室温冷却20 min后，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次；滴加3%过氧化氢溶液，常温孵育10 min以封闭内源性过氧化氢酶，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次；滴加兔抗大鼠RARα(1 ∶300)、阻抑素(1 ∶200)、ColⅣ(1 ∶100)及FN(1 ∶100)抗体，4℃孵育过夜，常温复温30 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3min/次；滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次；滴加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次；滴加新鲜配制的二氨基联苯胺显色剂；苏木素复染(约15 s)，0.1%盐酸酒精分化，后使用磷酸缓冲盐溶液返蓝；自来水冲洗，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。同时用磷酸缓冲盐溶液代替一抗作为阴性对照。随机选择肾间质区域20个视野(400倍)，尽量避开大血管，选择黄色区域为表达区域，采用Vectra成像分析系统进行半定量分析。分别统计3组切片阳性反应的平均吸光度(A)值。

1.6 检测肾脏组织中RARα和阻抑素mRNA的表达 从-80℃冰箱中取50 mg的新鲜冰冻肾脏组织，采用TRIzolTMLS Reagent试剂盒提取组织的总RNA，采用紫外分光光度计测A260、A280值及其比值，并计算RNA含量，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA的完整性和是否有降解，确定RNA完整后采用反转录试剂盒进行反转录。冰上充分溶解反转录试剂盒中相关试剂后行下列操作：PCR管中加入总RNA 0.3 μg,Oligo(dT)Primer 1 μL,再加无RNA酶水至12 μL,置于65℃下孵育5 min；然后在各个PCR管中加入2 μL 10 mmol/L dNTP混合物、4 μL 5×反应缓冲液、1 μL RevertAidTMM-MuLv和1 μL核糖核酸酶抑制剂，反应体系总体积20 μL，PCR仪上42℃ 60 min、70℃ 5 min完成返转录，获得cDNA。将cDNA放置于-20℃冰箱中贮存和备用。根据TakaRa公司生产的PCR反应体系(货号：RR820A)配置反应体系。反应体系(20 μL)：cDNA 1 μL,PCR上游引物(10 μM)0.5 μL,PCR下游引物(10 μM)0.5 μL，2.5×RealMasterMix/SYBR溶液9 μL，超纯水9 μL。 PCR反应条件：预变性时间为95℃ 10 min，变性68℃ 15 s，退火60℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，循环数设定为40。于ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR反应。采用β肌动蛋白作为内参，引物由上海生工公司设计和合成。RARα上游引物为5′-ATGTTCCCCAAGATGCTGAT-3′，下游引物为5′-CTGTCCGCTTAGAGTGTCCAA-3′；阻抑素：上游引物为5′-AAGCAGAGAGAGCCAGATTTGT-3′，下游引物为5′-TGATAAGCAATGTCCTCAGCAG-3′；β肌动蛋白：上游引物为5′-GCCCCTGAGGAGCACCCTGT-3′，下游引物为5′-ACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3′。采用相对定量2-△△Ct法[9]计算RARα、阻抑素mRNA的相对表达量，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，△△Ct=△Ct(试验组)-△Ct(对照组)。以假手术组为对照组，其各目的基因mRNA表达量为1。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验；采用Pearson检验进行相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠的RIF指数比较 Masson染色显示，肾小管及肾间质细胞胞浆、肌纤维染为红色，细胞核为蓝色，胶原纤维则染为绿色为阳性。RIF模型组肾间质绿色阳性面积较假手术组明显增大，说明RIF模型构建成功。造模后的第2周末和第4周末，假手术组、ATRA组、RIF模型组的RIF指数依次升高(均P<0.05)；在ATRA组、RIF模型组，第4周末的RIF指数均高于第2周末(均P<0.05)。见图1和表1。

表1 3组大鼠的RIF指数比较(x±s，%)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与RIF模型组比较，&P<0.05。

图1 3组大鼠肾脏组织Masson染色结果(×400)

2.2 3组大鼠肾小管间质ColⅣ和FN蛋白表达水平比较 造模后的第2周末和第4周末，假手术组、ATRA组、RIF模型组的ColⅣ和FN蛋白相对表达水平依次升高(均P<0.05)；在ATRA组、RIF模型组，第4周末的ColⅣ和FN蛋白相对表达水平均高于第2周末(均P<0.05)。见图2～3和表2。

表2 3组大鼠肾小管间质ColⅣ和FN蛋白的相对表达水平比较(x±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与RIF模型组比较，&P<0.05。

图2 3组大鼠肾脏组织ColⅣ蛋白表达情况(免疫组化染色，×400)

图3 3组大鼠肾脏组织FN蛋白表达情况(免疫组化染色，×400)

2.3 3组大鼠肾脏组织RARα、阻抑素蛋白和mRNA的表达水平比较 造模后的第2周末和第4周末，假手术组、ATRA组、RIF模型组的RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相对表达水平依次降低(均P<0.05)；在ATRA组、RIF模型组，第4周末RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相对表达水平均低于第2周末(均P<0.05)。见表3～4及图4～5。

表3 3组大鼠肾脏组织RARα及阻抑素蛋白的相对表达水平比较(x±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与RIF模型组比较，&P<0.05。

表4 3组大鼠肾脏组织RARα及阻抑素mRNA的相对表达水平比较(x±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与RIF模型组比较，&P<0.05。

图4 3组大鼠肾脏组织RARα蛋白表达情况(免疫组化染色，×400)

图5 3组大鼠肾脏组织阻抑素蛋白表达情况(免疫组化染色，×400)

2.4 相关性分析 模型组中，第2、4周末时，RARα蛋白表达水平与阻抑素蛋白表达水平均呈正相关(r=0.776，P=0.001；r=0.896，P=0.001)；RAR α蛋白表达水平与RIF指数、ColⅣ蛋白和FN蛋白表达水平均呈负相关(r=-0.823、-0.845、-0.875，P=0.001、0.001、0.001；r=-0.889、-0.879、-0.816，P=0.001、0.001、0.001)。

3 讨 论

ATRA是维生素A重要的一种衍生物，目前有不少学者发现其具有抗细胞外基质积聚及抗纤维化的作用[10-12]，但其抗RIF的机制尚不明确。部分研究表明ATRA可以发挥肾脏保护性作用。如Zhang等[13]通过阿霉素构建肾小球硬化大鼠模型进行研究，发现ATRA可能通过抑制瞬时受体电位阳离子通道6的表达，起到延缓肾小球硬化的作用。Tamaki等[14]对糖尿病肾病小鼠模型进行研究发现，ATRA可能通过RARα抑制骨形态发生蛋白4的表达，发挥减轻糖尿病小鼠肾小球基质积聚的作用。Liu等[15]通过5/6肾脏组织切除方法构建肾小球硬化大鼠模型，发现经ATRA治疗后肾小球硬化大鼠肾脏组织纤溶酶原激活物抑制剂-1和α平滑肌肌动蛋白表达下降，肾小球硬化延缓，肾功能得到改善。本研究进一步探讨ATRA是否可通过RARα调控阻抑素的表达，起到延缓RIF的作用。

本研究结果显示，与假手术组比较，RIF模型组大鼠肾脏组织RIF指数、ColⅣ和FN蛋白表达增加(P<0.05)，且第4周末的水平均高于第2周末，说明该组大鼠的RIF在进展；而RIF模型组RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表达水平均较假手术组下降，且第4周末的水平更低，且RAR α蛋白表达水平与RIF指数、ColⅣ蛋白和FN蛋白表达水平均呈负相关，这提示RARα可能是RIF的保护性因子。采用ATRA治疗后，虽然第4周末ATRA组大鼠RIF指数、ColⅣ和FN蛋白表达亦高于第2周末，但各个时间点其水平均较RIF模型组下降(P<0.05)，提示ATRA可延缓大鼠RIF的进展。此外，造模后的第2周末和第4周末，ATRA组大鼠RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表达水平均高于RIF模型组，且RIF大鼠的RARα蛋白表达与阻抑素蛋白表达水平呈正相关(均P<0.05)，因此我们推测ATRA可能通过上调RARα表达，对阻抑素表达进行调控，从而发挥延缓RIF进展的作用。

综上所述， ATRA能抑制RIF大鼠肾脏组织ColⅣ和FN的表达，同时，还可能通过上调RARα表达，以调控阻抑素的表达，从而起到延缓RIF进展的作用，但具体机制有待体外实验进一步研究。