马铃薯薯形基因StOFP20的克隆*

艾菊， 张泓欣, 罗威， 高冬丽

(云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500)

马铃薯原产于南美洲的安第斯山区，是茄科茄属一年生的双子叶植物.由于其耐性强、丰产性高、适应性广且营养成分全，在我国已经成为继小麦、水稻和玉米之后的第四大粮食作物[1].马铃薯块茎是生长在土壤中的缩短而肥大的变态茎.块茎形状简称为薯形，是马铃薯的重要农艺性状.薯形在块茎形成早期既已确定，不同的薯形是因为在块茎形成过程中，细胞向各个方向分裂和增大的速度不同所造成的[2-3].现有的栽培品种薯形比较规则，一般为圆形、椭圆形或长形.各地消费者对薯形的喜好不同，不同加工目的对薯形的要求也不同，因此薯形的选育将满足消费习惯的需求，加速马铃薯加工业的发展.

Van Eck等人首次详细地研究了薯形的遗传规律，利用二倍体杂交群体将控制圆形薯形的基因(Ro)定位在10号染色体，且圆形相对于长形是显性的[4].Prasher等利用二倍体杂交群体定位了2个薯形主效数量性状位点(QTL)，分别位于2号和10号染色体上，10号染色体上的QTL效应大于2号染色体上的QTL，此外还有3个微效QTL位于其他染色体上[3].Lindqvist-Kreuze等利用二倍体回交群体将薯形主效QTL定位在10号染色体上，此外在5号和12号染色体上的两个微效QTL对薯形也有影响[5].综上所述，薯形是一个相对简单遗传的性状，10号染色体上的Ro基因是控制块茎形状的主效位点，也存在其他位点的修饰效应.Endelman等在2016年将Ro基因定位在48.2-51.9 Mb的区间内[6].

番茄和马铃薯同属于茄科作物.目前已经克隆调控番茄果形的多个基因，包括SUN、OVATE、FAS(Fasciated)、sov1(suppressor of ovate ) 等[6-9].OVATE和sov1均属于OFP(Ovate Family Protein)家族，其中OVATE编码SlOFP1，sov1编码SlOFP20.Wu等人利用薯形分离群体发现，马铃薯中的同源基因StOFP20与薯形紧密连锁，是Ro位点的编码基因，因此，OFP20不仅调控番茄果实形状，同时也是马铃薯薯形的调控因子[10].但是，在Wu等的研究中没有提供StOFP20的编码序列，StOFP20在参考基因组DM中也是缺失的，且马铃薯DM基因组中约含有25个OFP基因，因此通过图位克隆，明确StOFP20的编码序列是必要的.研究利用一个薯形分离的群体，克隆了StOFP20，为进一步研究薯形调控机制提供基础.

1 材料与方法

1.1 DNA提取

将马铃薯的种子完全浸泡在2 mg/L的赤霉素溶液中，待24 h后将种子播种至湿度适中的土壤中.约15 d左右，将长出的一定高度的小苗移栽至96孔的穴盘内，待其长至约四片幼叶后进行采样.采集马铃薯的幼叶1-2片，采用CTAB法提取C151群体后代的基因组DNA.

1.2 分子标记验证

在前期的研究中，已经对C151自交群体进行了Bin分型[11].本研究利用16份Bin基因型不同的植株对InDel标记进行了验证.聚合酶链式反应(PCR)体系为：PCR体系11 μL，其中2×PCR master mix(Promega)5.5 μL，正向引物(10 μM)0.25 μL，反向引物(10 μM)0.25 μL,去离子水 4 μL,DNA 1 μL.PCR扩增程序为：94 ℃,3 Min;35个循环：94 ℃,30 Sec,55 ℃,30 Sec,72 ℃,15 Sec,循环结束后72 ℃ 5 Min.扩增片段用丙烯酰胺凝胶电泳鉴定.所用标记的引物序列为：S3aF-TTAGTGTAGGGGTAAAATGG,S3aR-TGCAGACCCTTAAACTTGTC;S4aF-GACTCTCAAAGAGGACGTTG,S4aR-TCCTCCAAGTGACTGAGACT;S5aF-CCCCTCCTTGACTTTTATTT,S5aR-ATACCCTTGGAGAAAATGGT; i-5F-ATTTAGGTGGGTTGAAGTGA, i-5R-ATAATCAACAGCCCATTCCT.

1.3 StOFP20的克隆

以叶片CDNA为模版，从后代分离群体中扩增StOFP20的序列.扩增引物为StOFP20F-A T G G G G A A T T A T A G G T T T A G A T T A T;S t O F P 2 0 R-T T A C T T C A G T C G A A T T T C A G T G A T G.StOFP20与SlOFP20的相似性比对采用NCBI blastp，OVATE结构域预测采用NCBI的Conserved Domain Search Service(CD Search).

2 研究结果

2.1 薯形分离群体的构建

C151是一个自交亲和的二倍体材料.利用该材料进行自交，自交后收获果实，并进行F2代播种(图1).对F2代植株的薯块进行调查，发现薯形出现圆形和椭圆形的分离，且在结薯初期能清楚地用肉眼进行表型鉴定(图2).

从左到右依次为：亲本CIP151的花；自交后的果实；经过清洗后的种子；播种后的幼苗

图1 自交分离群体的构建

Fig.1 Construction of a segregating population for tuber shape

从左到右依次为：亲本CIP151的薯形；后代的圆形薯块；后代的椭圆形薯块

图2 亲本CIP151自交后代的薯块形状

Fig.2 Tuber shape of the progeny obtained by selfing of the parent C151

2.2 StOFP20的精细定位

该群体的植株均已测序，并进行了Bin分型[11].根据文献报道的薯形基因的定位区间[6]，对该群体的相应区间48-52 Mb进行了分析，发现基因型与表型相符合，即基因型为b和h时，薯形为圆，基因型为a时，薯形为椭圆.根据基因型和表型，将区间定位在bin61-bin63之间，物理距离为834 kb(表1).在Bin61-Bin63之间设计多态性引物，并进行验证，找到4个能区分a、b和h基因型的InDel标记，分别为S3a、S4a、S5a和i-5，其中i-5的标记验证如图3所示.利用这4个标记对Bin61-Bin63之间的重组体进行分型，最终得到3种有效的重组体.C151-0758重组体的交换发生在S3a和S4a之间，基因型为ah，表型为圆形，说明基因在S3a之后；C151-0809重组体的交换发生在S5a和i-5之间，基因型为ah，表型为椭圆形，说明基因在i-5之前；C151-0044重组体的交换发生在S5a和i-5之间，基因型为ha，表型为圆形，说明基因在i-5之前.综上信息，将薯形基因定位S3a和i-5之间，物理距离为298 kb(图4).

表1 Ro基因的初步定位

图3 InDel分子标记i-5的开发

白色方框代表a基因型，即椭圆形基因型，黑色方框代表h基因型，即圆形基因型，箭头所指方向为基因所在的方向

图4Ro基因的精细定位

Fig.4 Fine-mapping of theRogene

2.3 StOFP20的克隆

以SlOFP20的序列比对该区间的基因，找到了同源基因StOFP20，该基因全长为1 041 bp，不含有内含子.利用薯形分离的植株扩增StOFP20，发现在基因型为b即圆形块茎中能够扩增出来，在基因型为a即椭圆形块茎中不能扩增出条带，与StOFP20在长形的DM块茎中缺失情况一致(图5).SlOFP20和StOFP20序列均有OVATE结构域，其蛋白相似性达到80%(图6).

图5 StOFP20在圆形薯块(基因型为b)和椭圆形薯块(基因型为a)中的扩增

方框为OVATE结构域

图6 StOFP20和SlOFP20的蛋白序列比对

Fig.6 Protein sequence alignment of StOFP20 and SlOFP20

3 讨 论

OFP基因数量众多，在拟南芥中有18个OFP基因[12]，在水稻和番茄中分别鉴定出31个和23个OFP基因[13].Liu等利用同源基因比对，在马铃薯参考基因组DM中鉴定出25个OFP基因，将其命名为StOFP1-StOFP25，其中StOFP20的编码基因是PGSC0003DMC400010028.DM是长形薯形，基因组中不含有与SlOFP20相似的基因，且PGSC0003DMC400010028在进化树上也没有与SlOFP20聚为一类[13].因此，将PGSC0003DMC400010028命名为StOFP20是不恰当的.

Wu等利用长形薯形的DM和圆形薯形的M6杂交群体，将Ro薯形位点定位到M6中包含有StOFP20的区间[10].由于在DM中StOFP20是缺失的，马铃薯公共数据库只提供了M6的基因组序列，Wu等的文章中也没有提供StOFP20的编码序列，因此StOFP20的完整编码序列是未知的.本文利用薯形分离的151自交群体，将Ro位点定位到298 kb内，并利用SlOFP20的序列进行比对，克隆了StOFP20.该基因可以在圆形薯形中扩增出来，但在椭圆形薯形的植株中不能扩增出来，与Wu等的研究结果一致[10].此外，作为标记能否扩增出来在实际操作过程中很难鉴定，如实验过程中的DNA质量和PCR过程失误都有可能导致扩增不出来，因此本研究提供的InDel标记能够清楚地区分圆形和椭圆形(长形)块茎，有利于将分子标记应用于薯形的早期选择.

番茄果实和马铃薯块茎的形成机制是完全不同的，番茄果实是子房受精膨大形成的，块茎是地下匍匐茎膨大形成的，OFP20可以调控马铃薯块茎和番茄果实的形状，由此可见OFP20的作用机制是保守的.番茄SlOFP20调节果实形状的机制可能是OFP20与TRM(TONNEAU1 Recruiting Motif)蛋白复合体在细胞质和微管的动态定位调控了细胞分裂，进而影响了番茄果实形状[10].在马铃薯中，OFP20是否与TRM互作共同调控块茎形状还需进一步研究.