G蛋白偶联受体MrgprD研究进展及对中医药研究的启示

王地均，金香，唐宗湘，王长明

(南京中医药大学医学院·整合医学院，江苏 南京 210023)

MrgprD(又名MrgD，TGR7)是具有7个跨膜蛋白的G蛋白偶联受体[1-2]。编码小鼠MrgprD的基因位于第7号染色体[3]，编码人MrgprD的基因位于第11号染色体[2]。MrgprD主要表达于外周背根神经节(DRG)神经元上，占整个DRG神经元数量的30%[1]。近几年的研究认为β-丙氨酸(β-alanine)是MrgprD特异性激动剂[2-4]，但是只激活50% MrgprD阳性的DRG神经元[3]。最初的研究认为MrgprD可能参与了疼痛的产生，并认为MrgprD阳性的神经元占整个植物凝集素B4(IB4，非肽能神经元标记物)阳性神经元的70%[1,3]。MrgprD也参与了痒觉的产生，研究发现β-丙氨酸激活MrgprD产生的痒是一种非组胺依赖的痒[4]。也有研究认为MrgprD和肿瘤的产生有关[5]，该受体也是肾素-血管紧张素受体的成员，参与了血管的收缩[6]。我们的研究发现了MrgprD参与神经病理性疼痛的新机制[7]，过去的研究认为MrgprD在痛觉、痒觉和肿瘤产生也有重要作用，因此我们将综述MrgprD的研究现状，为我们认识MrgprD的功能并为相关疾病治疗提供参考。

1 MrgprD的发现

2001年Dong发现外周感觉神经元表达一系列的G蛋白偶联受体(GPCRs)，命名为Mrgs，包括MrgA、MrgB、MrgC、MrgprD、MrgE、MrgF、MrgG几组成员。这些蛋白质具有相似的功能，其中一个成员MrgprD又命名为MrgD，特异性表达于伤害性感觉神经元上，主要是非肽能神经元(IB4阳性)，并且表达P2X3[1]。小鼠MrgprD基因位于第7号染色体，含有2个外显子，全长9 252 bp，mRNA编码含321个氨基酸残基的蛋白质[1,8]。人MrgprD基因位于第11号染色体上(11q13.3)，含有1个外显子，全长1 160 bp，mRNA编码含321个氨基酸残基的蛋白质[1,8]。MrgprD受体是神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)依赖c-Ret阳性神经元，小鼠MrgprD阳性的神经元是TRPV1阴性，但在大鼠却是部分TRPV1阳性的[8]。研究人员发现MrgprD受体的特异性激动剂β-丙氨酸可以激活TGR7受体即MrgprD[2]。随后的研究也证实了MrgprD的特异性激动剂是β-丙氨酸[3-4,9-12]。但是MrgprD阳性的神经元只占DRG神经元的30%，β-丙氨酸只能激活MrgprD阳性神经元的50%[3]。2005年Zylka等通过EGFP替代了小鼠MrgprD基因，生成了MrgprD基因敲除小鼠[13]，为我们研究MrgprD提供了研究工具。

2 MrgprD的分子生物学功能

2.1 MrgprD参与疼痛的产生

最初的研究发现MrgprD表达于外周伤害性感觉神经元上，认为MrgprD和疼痛的产生有关[1]。后期研究揭示了MrgprD分布及表达特性，MrgprD阳性的神经元主要是非肽能神经元，占IB4阳性神经元的76%，这些神经元发出的神经纤维都是无髓鞘的神经纤维，外周组织主要表达于皮肤的表皮层[13]。然而MrgprD如何和痛觉产生相关并不清楚，有研究认为MrgprD激活后抑制了KCNQ2/3钾通道，增加了背根神经元(DRG)神经元的兴奋性[9]。多数伤害性感受器都是多功能的，能接受多种不同的疼痛刺激，如热痛觉、机械性痛觉、冷痛觉等。研究发现MrgprD基因敲除小鼠在炎性痛模型中表现为对机械性伤害刺激的感受缺失，但是对冷刺激和热刺激的感受都无差异[14]。研究者推测，MrgprD基因敲除小鼠在出生后可能会有一些其他蛋白质替代MrgprD的功能。因此，研究者把白喉毒素受体(DTR)插入到MrgprD基因的位置，通过注射白喉毒素条件性删除表达MrgprD阳性的神经元。研究发现表达MrgprD的神经纤维可以快速的感受机械性刺激[15]。在体实验认为，表达MrgprD的神经纤维能感受捏或夹引起的刺激而不是轻抚引起的感觉，因此这种机械感觉和情感无关[16]。因此，一般认为MrgprD是一种和机械性感觉相关的G蛋白偶联受体。

MrgprD在肠道中表达，其中肠道巨噬细胞、T细胞表达MrgprD可能也和内脏疼痛有关[17]。也有研究认为5-氧代二十二碳烯酸(5-oxoETE)通过激活肠道MrgprD引起肠预激综合征(IBS)诱导的疼痛[18]。局部给予5-氧代二十二碳烯酸诱导小鼠内脏疼痛但不会引起组织炎症，因此认为5-oxoETE直接作用于DRG神经元。据此，MrgprD是否直接和内脏痛相关，还是通过巨噬细胞或淋巴细胞释放炎症因子引起疼痛尚存在争议。

神经病理性疼痛是一种难于治疗严重影响患者生活质量的疼痛[19-21]。TRP通道中多个成员都和神经病理性疼痛有关[22-23]。多个G蛋白偶联受体家族也参与了神经病理性疼痛的调控[24-26]。我们推测G蛋白偶联受体MrgprD可能也参与了神经病理性疼痛的产生。为了证实我们的假设，在野生型(WT)小鼠和MrgprD敲除小鼠造坐骨神经慢性压迫(CCI)模型，比较2种小鼠机械痛觉、热痛觉过敏以及冷痛觉过敏的差异。结果发现未造模组小鼠3种疼痛感觉都无差异，而神经病理性疼痛组小鼠机械痛和冷痛却有明显差异[7]。通过qPCR、免疫组化和钙成像结果发现神经病理性疼痛小鼠MrgprD的基因水平和蛋白水平都表达增多，功能也增强。研究中我们首次发现MrgprD和神经病理性疼痛的冷痛产生有关。TRPA1是已知的和冷痛有关的通道[27-28]。我们推测MrgprD下游通路可能和TRPA1相关。结果显示，92.99% MrgprD阳性的神经元表达TRPA1。钙成像和电生理结果显示，TRPA1阻断剂HC-030031明显抑制了β-丙氨酸激活MrgprD引起的钙内流以及内向电流。同时TRPA1基因敲除小鼠DRG神经元和β-丙氨酸的反应也是明显减少。为了进一步证实MrgprD下游通路是TRPA1，我们在HEK293细胞转染了MrgprD和TRPA1的质粒，结果发现同时转染MrgprD和TRPA1的细胞比仅转染MrgprD细胞与β-丙氨酸的反应明显增多。实验结果进一步显示β-丙氨酸激活MrgprD引起TRPA1磷酸化，该磷酸化可以被PKA抑制剂抑制。通过上述结果，我们认为MrgprD下游通过PKA-TRPA1途径参与了神经病理性疼痛冷痛的产生(图1)。过去的研究认为β-丙氨酸激活MrgprD引起痒觉行为[4]，我们推测MrgprD激活在神经病理性疼痛的病理条件下也可能会引起痛觉行为。通过高清摄像我们发现β-丙氨酸激活MrgprD既产生了痒觉(咬足行为)又产生了痛觉(舔脚行为)的行为，但是在神经病理性痛模型中，小鼠足底注射β-丙氨酸引起疼痛为主的舔脚行为。MrgprD通过PKA-TRPA1途径参与神经病理性疼痛的研究为我们揭示了神经病理性疼痛产生的新机制，也为我们认识疼痛的产生机理提供了新的思路，为治疗相关疾病提供了新的作用靶点。

2.2 MrgprD参与痒觉的产生

小鼠体内MrgprD阳性神经元代表了不表达TRPV1的C类纤维伤害感受器的主要亚群[13]。Noritaka等通过MrgprDDTA小鼠，用白喉毒素取代了MrgprD等位基因，可以选择性的删除MrgprD。他们通过注射组胺、氯奎等8种不同的引起瘙痒的化合物(不包含β-丙氨酸)，但是并没有发现这8种瘙痒物质可以通过MrgprD引起瘙痒[29]。

健身者喜欢食用β-丙氨酸使肌肉更加强壮，但会引起刺痛和瘙痒等不愉快的感觉。研究认为β-丙氨酸特异性激活外周MrgprD神经纤维引起瘙痒的行为是一种非组胺依赖的痒，这种痒觉抗组胺药物的治疗是无效的[4]。研究者给予WT小鼠和MrgprD基因敲除小鼠食用含有β-丙氨酸的糖水，发现WT小鼠产生瘙痒行为而MrgprD基因敲除小鼠没有瘙痒行为，所以β-丙氨酸特异性作用于MrgprD引起瘙痒。

方酸二丁酯(SADBE)可以引起过敏性接触性皮炎[30]。在SADBE小鼠瘙痒模型中，MrgprD阳性神经元表现出更多的去极化静息膜电位和更大的动作电位，钠电流增加引起的MrgprD阳性神经元的兴奋性增加，可能会导致接触性过敏反应相关的自发性瘙痒行为[31]。

MrgprD在瘙痒中的作用为我们研究神经系统中如何感知、编码和传输瘙痒信号提供了研究思路。同时，MrgprD参与非组胺依赖的痒也为我们治疗抗组胺药无效的痒觉提供了新的药物靶点。

2.3 MrgprD在肿瘤中表达

虽然多数研究认为MrgprD主要表达在外周感觉神经元，也有研究发现MrgprD在肺腺癌、低分化鳞状细胞癌、高分化鳞状细胞癌以及小细胞癌中都有明显表达。还发现在小鼠成纤维细胞系NIH3T3中过表达MrgprD会引起肿瘤形成[5]。在非小细胞肺癌中，肿瘤组织MrgprD的表达明显高于周围正常组织[32]。MrgprD在肺癌的形成中可能起着重要作用，可能成为非小细胞肺癌的标记物，也可能成为治疗非小细胞肺癌的分子靶点。目前为止尚未发现其他肿瘤组织中有MrgprD的表达。MrgprD如何参与了肿瘤的形成以及是否其他肿瘤的形成有关，有待我们进一步的研究。

2.4 MrgprD在血管中表达

肾素-血管紧张素(RAS)系统在调节血压及心血管疾病发生中起着重要作用。研究发现MrgprD可以参与血管紧张素Ⅲ(Ang Ⅲ)的激活引起花生四烯酸的释放[33]。Alamandine是血管紧张素转化酶-2催化产生的新的7肽，可以激活MrgprD诱导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)生成增多使血管舒张[34-35]。Habiyakare等发现兔的主动脉MrgprD与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)共表达，在正常家兔Alamandine与MrgprD结合增强乙酰胆碱引起的胸主动脉和髂动脉血管舒张功能，但是在动脉粥样硬化的家兔主动脉却没有这种功能，同样说明MrgprD参与了血管的舒张[36]。血管紧张素Ⅱ型受体(AT2R)和MAS受体是肾素-血管紧张素系统的重要保护组件。Villela等在实验中使用内源性代谢产物Alamandine观察到与其受体MrgprD的作用[37]。研究者又发现MrgprD下游通道通过CAMP-PKA途径发挥作用[6]。Alamandine和MrgprD级联作用的研究为我们认识心血管疾病提供了一个重要线索[38]，为心血管疾病治疗提供了新的药物作用靶点。

3 MrgprD与中医药止痒镇痛

中医药在止痒、镇痛等方面效果明确，副作用小。研究认为川芎(Lamiophlomis rotata)通过激活脊髓胰高血糖素样肽-1受体有镇痛作用[39]。雷公藤内酯醇通过大麻素受体-2抑制神经病理性疼痛以及骨癌痛[40]。这些中药成分都是作用G蛋白偶联受体起镇痛作用。但是中医药成分复杂，多数中药止痒、镇痛的分子生物学机制目前都不清楚。本文中我们将探讨的MrgprD就是一种表达于外周，和感觉产生相关的G蛋白偶联受体。

我们过去的研究认为，乳香、末药在治疗神经病理性疼痛方面通过作用于瞬时感受器电位离子通道(TRP)来减轻机械疼痛和热痛。中药药对乳香、末药通过抑制TRPV1的表达及功能而镇痛[41]。中药的作用经常是多靶点的，可能通过多个不同的通道或受体发挥镇痛或止痒作用。许多中医药镇痛、止痒的分子生物学机制目前并不清楚，我们初步试验结果认为有些中药单体成分可能通过作用于MrgprD起镇痛作用。通过这些通道或受体，我们还可以筛选效果较好的镇痛、止痒的中药单体成分，为中医药的推广和利用铺平道路。

4 展望

自2001年被发现，MrgprD功能的研究越来越受到关注。作为G蛋白偶联受体的一名成员，参与痛觉、痒觉的产生，同时又和肿瘤的形成、血管的舒张有关(图1)。痒觉及痛觉信号可以激活MrgprD通过PKA-TRPA1途径传入中枢最终引起痛觉或痒觉的产生；Alamandine通过MrgprD介导血管的舒张；MrgprD参与了肿瘤的形成。MrgprD在痛觉和痒觉中的作用已经得到证实，但是其调节痛、痒的分子生物学机制仍需进一步探讨。MrgprD调节痛、痒的研究为治疗痛、痒相关疾病提供了药物作用的靶点，为开发新的止痛和止痒药物提供了新的思路。虽然目前认为β-丙氨酸是MrgprD特异性激动剂，但是只激活MrgprD阳性神经元的50%。我们并不清楚其他50%MrgprD阳性神经元功能是什么，也没有找到能够激活绝大多数MrgprD阳性神经元的特异性激动剂。另外，有研究认为MrgprD和血管的舒张有关，并且下游通过Camp-PKA途径参与了血管的舒张，但是否还有其他内源性物质可以激活MrgprD以及如何通过MrgprD和血管舒张有关，以及以后如何开发相关药物，治疗心血管疾病仍需很长的路要走。也有研究认为MrgprD参与了肿瘤的形成，但是MrgprD是如何参与肿瘤的产生的，以及具体的机制并不清楚。这些肿瘤相关的研究使MrgprD可能成为抗肿瘤药物的作用靶点。MrgprD作用机制的研究为痛、痒的产生机制，肿瘤的发生，血管的舒张提供了重要的思路和线索，为药物的研发提供了新的作用靶点。随着我们对这种G蛋白偶联受体研究的深入，MrgprD作用的分子生物学机制将逐渐被我们认识。

此外，中医药在止痒、镇痛方面效果明确、副作用小，但是其分子生物学机制并不清楚。目前的研究中我们以MrgprD为靶点，探索中医药止痒、镇痛的分子生物学机制，同时还可以筛选中药的止痒、镇痛或抗肿瘤的成分，期望能为中医药的推广和传播做出应有的贡献。