重组人白血病抑制因子蛋白对兔椎间盘退变模型髓核细胞凋亡的影响机制Δ

穆 林，房 昕，龚 箭，高迎庆，周 强（.铁岭市中心医院骨科一病房，辽宁 铁岭 000； .中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院骨科，重庆 40003）

腰椎为临床椎间盘退变性疾病的常见部位［1］。 正常椎间盘由中央部的髓核组织和周围部的纤维环组成，髓核组织又由退变髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）及其周围蛋白多糖黏液样细胞外基质（extracellular matrix，ECM）构成。 近年来研究结果显示，NPCs 凋亡与椎间盘进行性退变存在关联［2］。 重组人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）因可抑制小鼠M1 白血病细胞增殖而得名，在活化T 细胞、单核细胞及骨髓基质细胞等中均发现其表达［3］。 研究结果显示，LIF 可参与调控特定细胞的增殖分化、骨代谢和炎症反应等活动［4］。 本研究采用针刺法构建兔椎间盘退变模型，探讨了重组人LIF 蛋白对退变NPCs 凋亡的影响机制，旨在为临床椎间盘退变性疾病的治疗提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 动物

实验用新西兰大白兔购自上海甲干生物科技有限公司，40 只，雄性20 只，雌性20 只，平均月龄（3.36±1.23）个月，平均体质量（2.51±1.12） kg，12 h／12 h 昼夜交替适应性喂养，充足水和食物。

1.2 主要试剂和仪器

重组人LIF（美国eBioscience 公司）。 总蛋白提取试剂盒（普利莱基因技术有限公司，货号P1250）；Annexin V-FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，货号BB-4101）。 LIF 兔抗人单克隆抗体、ERK1／2 鼠抗人单克隆抗体、p-ERK1／2 鼠抗人单克隆抗体、JNK 鼠抗人单克隆抗体、p-JNK 鼠抗人单克隆抗体、p83 鼠抗人单克隆抗体及p-p83 鼠抗人单克隆抗体均购自美国Abcam 公司；蛋白聚糖（Aggrecan）鼠抗人单克隆抗体、Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体均购自美国Cell signaling technology 公司；GADPH 鼠抗人单克隆抗体（碧云天生物科技有限公司）。 流式细胞仪（美国BD 公司）；1.5T磁共振仪（德国西门子公司）。

1.3 兔椎间盘退变模型构建及评价

采用针刺法，具体步骤如下：将实验用新西兰大白兔随机分为模型组和对照组，每组20 只。 模型组兔采用针刺法［5］经L4—5节段椎间盘侧方倒八字入路，利用18G 针头由纤维环刺入髓核中心，明显落空感后旋转针头3 圈，停留5 s 后拔出，0.9%氯化钠溶液冲洗手术部位，缝合切口。 对照组兔操作部位和方法同模型组，但不进行针刺操作。 术后两组兔均给予青霉素8 万U，腹内注射。 术后行磁共振成像检查，分别测量手术部位最高点、椎体前后缘椎间盘高度，取平均值，利用Image J 软件分析各组椎间盘髓核组织5 个层面平均信号强度与背景噪声，计算信号-噪声比（SNR）。

1.4 标本收集及处理

髓核组织：取模型组和对照组兔相应手术节段椎间盘髓核组织，裁剪为1 mm×1 mm×1 mm 标本，制作组织切片。 退变NPCs 分离：取模型组兔相应手术节段椎间盘髓核组织，采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法［6］分离培养模型组兔的NPCs，取P3 代细胞进行培养，生长融合度达80%左右分别加入0、10、20、50 及100 ng／ml 重组人LIF 处理72 h。

1.5 Western Blot 法检测蛋白表达水平

利用总蛋白提取试剂盒提取髓核组织和不同浓度重组人LIF 因子处理退变NPCs 总蛋白；采用BCA 法检测髓核组织LIF蛋白浓度、退变NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型胶原浓度和退变NPCs 中JNK、p38、ERK1／2、p-JNK、p-p38 及p-ERK1／2 浓度。

1.6 Annexin V-FITC／PI 双染法检测细胞凋亡

采用Annexin V-FITC／PI 双染法检测退变NPCs 凋亡，按照试剂盒说明书操作，流式细胞术观察凋亡情况，以Annexin V 为横轴，PI 为纵轴，左上为机械性损伤细胞，右上为晚期凋亡细胞或坏死细胞，左下为正常细胞，右下为早期凋亡细胞。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组椎间盘高度和SNR 比较

模型组兔的平均椎间盘高度为（76.21±4.23） mm，明显低于对照组的（102.12±5.38） mm，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组兔的SNR 为18.56±2.13，明显低于对照组的42.56±1.97，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 髓核组织LIF 蛋白表达

Western Blot 实验结果显示，模型组兔髓核组织中LIF 蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；针刺2周、4 周及8 周兔髓核组织中LIF 蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.3 重组人LIF 蛋白对退变NPCs 凋亡的影响

流式细胞术结果显示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重组人LIF蛋白处理退变NPCs 凋亡率分别为（47.98±1.35）%、（43.65±1.42）%、（41.12 ± 1.38）%、 （38.14 ± 1.36）% 及（36.52 ±1.34）%；0、10、20、50 及100 ng／ml 重组人LIF 蛋白处理的退变NPCs 凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 重组人LIF 蛋白对退变NPCs 细胞外基质表达的影响

Western Blot 实验结果显示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重组人LIF 蛋白处理的退变NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型胶原表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.5 重组人LIF 蛋白对MAPK-ERK1／2 通路的影响

图1 髓核组织LIF 蛋白表达Fig 1 Expression of LIF protein in nucleus pulposus

图2 重组人LIF 蛋白对退变NPCs 细胞外基质表达的影响Fig 2 Effects of recombinant human LIF protein on extracellular matrix expression of degenerated NPCs

Western Blot 实验结果显示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重组人LIF 蛋白处理的退变NPCs 中p-ERK1／2 蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

3 讨论

腰椎间盘退行性病变为骨科常见疾病，以腰痛、下肢疼痛麻木为主要临床表现［7］。 腰椎间盘退行性病变病因尚未明确，大多认为与腰椎间盘纤维环、髓核和软骨终板退变有关［8］。 兔NPCs 的结构和成分与人类较为相似且有较好经济性和可重复性，为临床常用椎间盘退变模型［9］。 本研究采用针刺法构建了兔椎间盘退变模型，结果显示，模型组椎间盘高度和SNR 均显著低于对照组，提示模型构建成功［10］。

图3 重组人LIF 蛋白对MAPK-ERK1／2 通路的影响Fig 3 Effects of recombinant human LIF protein on MAPK-ERK1／2 pathway

LIF 最早被发现于鼠类M1 型白血病，因可抑制小鼠M1白血病细胞增殖而得名。 近年来研究结果发现，LIF 为具有生物多样性活性的分子，在很多病理生理过程中起着重要作用［11］。 本研究结果发现，模型组兔髓核组织中LIF 蛋白表达水平高于对照组，随针刺时间延长而降低，提示兔椎间盘退变髓核组织中LIF 蛋白呈高表达，且随退变程度上升。 黄艳等［12］研究结果发现，LIF 可作用于异位子宫内膜间质细胞，促进血管生成因子分泌，参与疾病发生和进展。 Hunt 等［13］的研究结果发现，LIF 可与LIF 受体结合调控肌肉细胞生长、肌源性分化、运动反应、代谢、神经支配和炎症细胞向肌肉损伤部位募集。 本研究结果显示，退变NPCs 凋亡率随重组人LIF 蛋白处理浓度增加而升高，提示LIF 高表达可抑制退变NPCs 凋亡，且随其表达水平升高抑制作用越明显。 椎间盘退变早期多表现为髓核脱水、纤维环撕裂和软骨终板形成裂隙［14］。 随着疾病进展可发展为软骨终板骨化、椎体终板物质交换通道变窄，导致大量酸性物质和基质降解产物堆积在椎间盘内堵塞交换通道，加重纤维环退变，最终引起纤维环髓核脱出［15］。髓核由软骨样NPCs 及其周围ECM 构成。 近年来研究结果发现，NPCs 代谢及ECM 分泌与椎间盘退变发生发展存在关联［16］。 有文献报道，细胞外基质成分的变化可破坏椎间盘细胞生存内环境，使椎间盘发生退变［17］。 Aggtecan 蛋白和Ⅱ型胶原为ECM 重要组成成分，可有效缓冲加载于椎体的应力和维持椎间盘正常高度［2］。 本研究结果显示，退变NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型胶原表达水平随重组人LIF 蛋白处理浓度增加而升高，提示LIF 蛋白可促进退变的NPCs 合成ECM成分，抑制椎间盘退变。 丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK）信号通路真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，对调控细胞生长、分化、凋亡和死亡等生理过程具有重要意义［18］。 其中，ERK、JNK 和p38 为MAPK 信号通路主要亚群［19］。 有文献报道，MAPK 信号通路参与膝关节软骨退变过程［20］。 本研究利用不同浓度重组人LIF 蛋白处理退变NPCs 发现，重组人LIF 蛋白对p-JNK、p-p38 无明显作用，而p-ERK1／2 蛋白表达水平随重组人LIF 蛋白处理浓度增加而升高，提示LIF 可通过促进ERK1／2 蛋白磷酸化激活ERK1／2 通路，促进细胞外基质合成达到抑制NPCs 凋亡作用；在椎间盘内注射重组LIF 因子有可能通过抑制NPCs 凋亡延缓椎间盘退变的进展。

综上所述，兔椎间盘退变髓核组织中LIF 蛋白呈高表达，其可能通过激活ERK1／2 通路促进细胞外基质合成达到抑制NPCs 凋亡作用，重组LIF 对延缓椎间盘退变进展显示出了良好前景。