安吉白茶白化叶和返绿叶叶绿体超微结构和叶绿素及其前体物含量的比较

杨荧 吕立堂 赵德刚

摘要：安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）是典型的白化茶树品种，为了对其叶片白化现象进行探究，本研究观察了安吉白茶的白化叶和返绿叶的叶绿体超微结构，发现白化叶叶绿体内部结构发育不良，基粒片层排列疏松散乱，片层间缝隙大，层次不清晰，甚至断裂不成形，根据对叶绿素及其前体物质含量的测定和对叶绿素合成的相关基因在两个阶段叶片中的表达量测定结果发现，Mg-proto Ⅸ在白化叶中含量要高于返绿叶，推测叶绿素合成阶段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a时受阻，确定安吉白茶发生白化是由于叶绿体发育不良，同时叶绿素合成阶段的Mg-proto Ⅸ合成Pchlide a时受阻所致。

关键词：安吉白茶;叶绿体;超微结构;叶绿素前体物

中图分类号：S5711

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）06-0071-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.013

Comparison of Ultrastructure， Chlorophyll and Precursor Contents of Chloroplasts between Albino Leaves and Green Leaves in Camellia sinensis ‘Baiyel 1

YANG Ying1，LV Li-tang2*，ZHAO De-gang1，3

（1.College of Tea / Research Institute of Agricultural Bioengineering， Guizhou University， key Laboratory of Germplasm Innovation for Conservation and Protection of Mountain Plant Resources， Guiyang， Guizhou 550025，China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang，Guizhou 550006，China）

Abstract：Camellia sinensis cv. Baiye1 is a typical albino tea cultivar. In order to investigate the albinism phenomenon of its leaves， the chloroplast ultrastructure of the albino leaves and the green leaves of Camellia sinensis cv. Baiye1 were observed， and it was found that the internal structure of the chloroplasts in the albino leaves was stunted. The grana lamellae were scattered and loosely arranged with big gaps， and the lamellar structure was not clear， even fractured. According to the determination of the content of chlorophyll and its precursors， and the expression of genes related to chlorophyll synthesis in leaves of two stages ， it was found that the content of Mg-proto IX in albino leaves was significantly higher than that in returning green leaves and speculated that the synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX was blocked in the chlorophyll synthesis pathway. These results indicate that the albinism of Camellia sinensis cv. Baiye1 was due to chloroplast dysplasiaand the blocking synthesis of Pchlide a from Mg-proto IX.

Key words：Camellia sinensis cv. Baiyel; chloroplast; ultrastructure; chlorophyll precursor

茶湯中含有的茶多酚、氨基丁酸、脂多糖，微量元素锰、锌、硒，茶坩宁等具保健作用，以茶树白化突变体为原料制成的绿茶滋味鲜爽，香气、外形、汤色、叶底等品质优秀，提高了其经济价值[1]，同时由于叶绿素含量降低，氨基酸含量明显增高，使茶树白化突变体制成的茶具有更高的营养价值[2]，植物的叶色突变与叶绿素的合成及叶绿体的发育息息相关[3-4]，安吉白茶（Camellia sinensis 'Baiye1'）作为典型的白化茶品种，经研究发现返白过程中氨基酸升高，叶绿素含量则下降[5]。本研究以安吉白茶为研究材料，对其白化叶和返绿叶叶绿体超微结构和叶绿素及其前体物含量进行比较和研究，以揭示安吉白茶白化的原因。

1材料与方法

11材料

安吉白茶（Camellia sinensis ‘Baiye1）的白化叶及返绿叶作为研究材料，采样于中国贵州六盘水市六枝特区黑晒村茶园（由四川引种），白化叶和返绿叶均处于相同的叶片发育阶段，由本实验室保存。

1材料與方法

11试验材料

供试品种：云烟87。供试烟杆醋液：由贵州省烟草科学研究院制备。自然风干的烟杆进行干馏处理后，除得到炭之外。还能收集到一些液态干馏物，其中间一层赤黄色的液体通过静置过滤后所得液体，pH为376。

12试验设计

试验于2019年3月至6月在贵州省烟草科学研究院福泉基地进行。普通塑料大棚内，采用漂浮育苗法培育烟苗。苗床高10 cm，水深4 cm。以不添加烟杆醋液为对照（CK），设置3个烟杆醋液浓度处理：T1，烟杆醋液稀释200倍;T2，烟杆醋液稀释400倍;T3，烟杆醋液稀释600倍。分别于播种前、播种后20 d和播种后40 d分3次添加烟杆醋液，采用完全随机设计，每个处理3次重复。苗期管理按烤烟集约化育苗技术规程操作。

13测定项目及方法

育苗盘每穴播1粒种子，播种后15、20、30 d调查出苗率[出苗率（%）=出苗种子数/试验用种子数。在成苗期（8叶1心）每盘随机取5株烟苗，参照《YC/T142—1998烟草农艺性状调查方法》，测定烟苗的茎高、茎围、地上部分与地下部分干重等;

采用WinRHIZO植物根系扫描系统测定幼苗根系结构;采用乙醇提取法测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量[13];采用TTC法测定烟苗根系活力[14];采用 Li￣6400XT 便携式光合作用测定仪和 6400￣02B红蓝光源（美国Li￣cor公司）测定幼苗光合指标;采用M系列IMAGING￣PAM （WALZ，德国）调制叶绿素荧光成像系统，选择烟苗第2～3片叶自上而下进行叶绿素荧光动力学参数的测定;采用磺胺-萘胺比色法测定烟苗硝酸还原酶活性[15]。

2结果与分析

21烟杆醋液对烤烟种子出苗的影响

由表1可以看出，烟杆醋液不同稀释浓度对烤烟种子出苗影响不同，出苗率均随育苗期延长而增大，未出现完全不出苗现象。CK处理在播种后15、20、30 d的出苗率与T2处理无明显差异，且均高于T1处理;而T3处理在播后15、20 d的出苗率低于CK及T2处理，在播后30 d则高于CK及T2处理。播种后30 d，T3处理较CK、T2处理的出苗率分别高284、305个百分点。这说明烟杆醋液对烤烟种子出苗有影响，且随培育时间的延长，T3处理的种子出苗率高于其他处理的种子出苗率。

22烟杆醋液对烤烟幼苗植物学性状的影响

由表2可知，烟杆醋液对烤烟幼苗的生长有较大影响，在烤烟幼苗成熟期，不同烟杆醋液的稀释浓度处理均改变了烤烟幼苗植物学性状。从整体指标可以看出，T1处理下的植物学性状显著弱于T3处理，且T3处理茎高较T1处理的增幅为683%，差异达到显著水平，说明高浓度下烟杆醋液对烤烟幼苗的生长效果弱于低浓度处理。各处理茎叶重范围为08102～09500 g/株，且茎叶重随烟杆醋液浓度减小而增大;T2处理与对照处理间无显著性差异，但植物学性状均强于T1处理。烤烟幼苗植物学性状综合表现为较低浓度处理效果优于高浓度处理。

23烟杆醋液对烤烟幼苗根系结构的影响

根系结构可反应植株生长情况。从表3可以看出，烟杆醋液稀释400倍处理较对照处理有一定影响，但不明显，无显著差异，尤其以总根表面积与根尖数未达到显著水平。而烟杆醋液稀释600倍处理较其他处理对烤烟幼苗根系结构的影响有一定差异，根系生长明显优于其他稀释倍数处理，即低浓度下烟杆醋液的表现最佳。各处理下根尖数范围为3276～3544，其中T3处理较对照及T1处理的增幅分别为225%、818%，同样说明高浓度下的烟杆醋液的根尖数显著低于低浓度处理。

24烟杆醋液对烤烟幼苗根系活力的影响

从图1可以看出，烟杆醋液的施用对烤烟幼苗根系活力的影响较大，烟苗成苗期CK、T1、T2、T3处理根系活力为别为0503、0392、0534、 0621 mg·g-1·h-1。在烟杆醋液稀释200～600倍的范围内，随烟杆醋液稀释倍数的增大，各处理下烤烟幼苗根系活力均显著提高，其中T3处理显著高于 CK、T1、T2处理，且差异显著，增幅分别为2346%、5842%、1629%。由此说明，烟杆醋液稀释较高倍数下的处理表现最好，对于根系活力的提高有明显作用。

25烟杆醋液对烤烟幼苗色素含量的影响

植物在进行光合作用时主要通过光合色素捕获光能，而叶绿素和类胡萝卜素起主要作用。从表4可以看出，烟杆醋液的施用对烤烟幼苗的色素含量产生了影响。烤烟幼苗在培育至成苗期时，CK处理及T2处理下总叶绿素、类胡萝卜素含量的变化趋势相近，其含量处于T1及T3处理间。以T1处理的色素含量最低，T3处理色素含量最高，二者间存在显著性差异，其中类胡萝卜素含量差异达到显著水平，T3是T1处理含量的015倍。总体而言，不同处理下烤烟幼苗色素含量表现为高浓度烟杆醋液下的色素含量低于低浓度处理。

26烟杆醋液对烤烟幼苗气体交换参数的影响

从表5可以看出，除T1处理外，烤烟幼苗成苗期的各浓度处理均对烤烟幼苗光合特性有一定程度的促进作用，且各气体交换参数随着烟杆醋液浓度降低而增大。其中，各处理下幼苗叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及胞间二氧化碳浓度均以T3处理最大，其次是T2 处理及CK处理。T1处理较CK、 T2、T3处理均有差异，但较T3处理差异显著;不同处理下蒸腾速率及胞间二氧化碳浓度表现趋势较接近。由此说明较低浓度下的烟杆醋液更能促进烤烟幼苗的光合特性。

27烟杆醋液对烤烟幼苗叶绿素荧光参数的影响

植物叶绿素荧光信号是一种理想的光系统探针，能反应植物的生理生态及其与环境的关系[16]。Fv/Fm值是暗反应条件下PSII最大光化学量子产量，即潜在的光合速率;Y（Ⅱ）值是 PSII反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，即实际的光合速率[17];qP是光化学猝灭。由表6可以看出，整体上，各处理的最大光化学效率 （Fv/Fm）、光化学淬灭系数（qP）、实际光合速率Y（Ⅱ）均高于烟杆醋液稀释200倍（T1）处理;NPQ 是非光化学猝灭，表示不能被电子传递利用的以非光化学形式释放的过剩光能，能够保护光合系统[18]。表中不同处理的NPQ均不同程度低于T1处理，其中以烟杆醋液稀释600倍（T3）处理表现出最小值。结果看出，除NPQ外，烤烟幼苗的Fv/Fm、qP、Y（Ⅱ）的值均随烟杆醋液稀释倍数的增加呈增大趋势。

28烟杆醋液对烤烟幼苗NR活性的影响

硝酸还原酶是NO3-同化过程中的第一个关键酶和限速酶，其活性能够表明植株营养状况和氮代谢水平[19]。由图2可知，不同处理间烟苗成苗期硝酸还原酶活性差异显著。其中，T3及CK处理NR分别为6645、6202 μg/g·h，T3处理较对照处理增加了714%，同时其NR活性显著高于T1处理;T2与CK处理间无显著差异，但都高于T1处理。由此说明，高浓度下的烟杆醋液影响了烤烟幼苗的营养情况，抑制了烤烟幼苗的氮代谢。

3结论与讨论

试验结果表明，在常规漂浮育苗的基础上施用烟杆醋液，不同的稀释倍数处理下烤烟幼苗生育表现出不同的差异。在烟苗培育后期，烟杆醋液稀释200倍处理下的烤烟种子出苗率均低于其他处理，这与刘艳梅等[20]研究的高浓度竹醋发酵液抑制种子发芽的试验结果类似。许灵杰等[21]的研究結果表明，相对较低浓度下的木醋液对种子的萌发有促进作用。同样，本试验前期以烟杆醋液较低浓度（稀释400倍）处理较其他浓度更能促进烤烟种子出苗，有较高的出苗率，而在成苗期稍低于600稀释倍数。这或许是高浓度的烟杆醋液在短期内促进了部分有益微生物的活性，不但分解了烤烟种子在萌发过程中的有害物质，还分泌了种子萌发所需的激素及酶类，因而，前期高浓度处理下的烟杆醋液促进了烤烟种子的出苗。但随着培育时间的延长，微生物的生长会增加对部分元素的需求，从而减少了种子萌发所需元素，因此，在培育后期，低浓度烟杆醋液处理下的出苗率反而高于高浓度处理[22-23]。

在成苗期，除烟杆醋液稀释200倍处理外，随着烟杆醋液稀释倍数的增大，植物学性状及根系结构依次得到改善，原因可能是烟杆醋液中所具有的类似激素类物质能调节植株的生长[24]，而生物质材料中确实富含能够促进作物生长的营养物质[25]。但高浓度处理却抑制了烤烟幼苗的生育，说明烟杆醋液浓度存在一定的阈值。丰明晓等[26]的研究结果也表明了木醋液调节途径与生长素IAA相似。本试验中，T3处理下烤烟幼苗成苗期根系活力较CK处理得到提升，与王晓等[27]研究的木醋液在稀释倍数相对较高的处理下能促进烤烟根系活力的结果相似。原因可能是一定浓度的烟杆醋液能提高根际有益微生物的数量，分泌能够促进根系活力、养分吸收的代谢产物[28]。色素是植物进行光合作用的物质基础，其光合速率来自于色素的组成与比例[29]。毛凯伦等[12]通过叶面喷施木醋液于烤烟，结果增加了烤烟烟叶的色素含量，促进了烤烟的生育。这与本试验研究结果一致。原因可能是烟杆中含有植物碱盐、单宁、色素、有机酸盐、氨基酸、蛋白质等[30]，烟杆醋液通过对作物光合作用及生理代谢等方面的调控，促进了氮利用率，从而达到了提高烤烟幼苗色素含量的目的。光合生理指标可作为植物对光能利用能力最综合的评价[31]。试验中，施用烟杆醋液稀释200倍处理下的各生理指标低于CK对照，或许是高浓度烟杆醋液的施用对吸收光强产生了影响。光合作用是植物生长发育的基础，是植物合成有机物质和获得能量的根本[32]。通过荧光参数分析可了解光合机构内部调节过程。本实验中，T3处理下，Fv/Fm、qP及Y[II]值较CK处理大，NPQ较CK处理小，说明叶片吸收的光能较充分，PSII电子传递能力较强，光合碳同化所需的ATP 较为充足。可见，烟杆醋液低浓度处理更能促使光耗散减少，对强光具有最大适应性。推测原因可能是烟杆醋液改善了烤烟幼苗根际微生物环境，提高了幼苗PSII反应中心的潜在活性和实际光能转化效率。植物的氮素代谢取决于硝酸还原酶活性[33]。本试验结果表明，烟杆醋液稀释倍数在越大的情况下更能促进烟苗叶片中NR的形成，使烟苗氮代谢改善，进而对氮的吸收利用提高。推测原因是烟杆醋液本身成分较复杂，可能提供了氮素而增加了硝酸还原酶反应底物，从而提高了NR活性。

但本试验的结果存在一个局限性，即不明确烤烟幼苗的综合指标是否随着烟杆醋液稀释倍数的的增大得到更大程度的改善，或者反而走向转劣趋势，即一定的浓度阈值;且目前关于木醋液对作物的影响研究多集中于作用效果的探索上，有关机理性的探究不够系统，对此还需对其进行下一步研究。

本研究以云烟87为试验材料，采用漂浮育苗法，对烤烟幼苗的生长及生理特性进行了探究，表明以烟杆为原材料制取的醋液对烤烟幼苗生育有影响，即高浓度处理对烤烟幼苗的生长发育有抑制作用，适宜低浓度对烤烟幼苗的生长发育有促进作用。

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