口岸鼠体寄生螨类分子鉴定

重庆国际旅行卫生保健中心（重庆海关口岸门诊部）（重庆，401147）

螨类种类众多，是影响农业、畜牧业和公共卫生的重要节肢动物。其中能引起人类疾病的种类有革螨，疥螨，恙螨，蠕形螨，粉螨和尘螨等。螨类体型微小，生境复杂，都给螨类研究带来挑战。在螨类的分类鉴定，生态学，病原生物传播等领域存在较多空白[1-3]。

鼠体寄生螨类是重要病媒生物，格氏血厉螨、厩真厉螨、阿尔及利亚螨和柏氏禽刺螨等均能自然感染森林脑炎、出血热、Q热、鼠疫和土拉弗氏菌等自然疫源性疾病，小盾纤恙螨和毒棘厉螨均可携带SFTSV，具有传播SFTS的可能，革螨和恙螨是肾综合征出血热传播媒介，恙螨还是恙虫病立克次体的传播媒介[4-8]。

螨类的种群鉴定以形态学鉴定为主。但是形态学鉴定标本制作过程复杂，需要长时间经验积累。随着分子生物学技术在物种种群鉴定中的成功应用，建立螨类分子鉴定技术对准确快速确定螨类种群意义重大。贺丽敏等建立了基于COⅠ和ITS2的蒲螨分子鉴定方法，鉴定结果与形体学鉴定一致；张星星等利用COX1基因对鸡皮刺螨进行鉴定，伍祎等建立了基于COⅠ的储藏物螨类分子鉴定技术，王少丽等建立了截形叶螨的分子鉴定方法。但是目前还没有针对鼠体寄生螨类的分子鉴定方法建立的研究[9-12]。

1 材料与方法

1.1 蜱螨类标本采集

采集重庆江北机场，寸滩港，涪陵港，万州港，湖北宜昌港和满洲里等口岸鼠体寄生螨类。螨类采集方法参考《国检字（2001）61 号》，质检卫函（2016）16号文件规定方法实施。使用鼠笼法捕捉鼠类进行鼠体寄生螨类搜集。将鼠类用乙醚麻醉后搜集鼠体寄生螨类，对螨类进行分类，用于制作形态学标本投入70%酒精保存制作玻片标本，用于分子鉴定的标本置离心管于-80℃保存。

1.2 螨类分子鉴定

1.2.1 引物筛选

查阅文献和NCBI中蜱螨分子鉴定序列，设计鼠体寄生螨类分子鉴定引物序列。包括用于扩增COⅠ，COⅡ，Cytb，ITS2的通用引物如下：

表1

1.2.1 核酸提取

螨类初步形态学鉴定后，选取形态一致的3-5只个体为一组，进行核酸提取，同时对所选标本进行拍照。将样本加入200ul PBS冷冻研磨，使用Qiagen DNA提取试剂盒，按照说明书提取DNA，4℃保存，备用。

1.2.2 PCR扩增程序及产物分析

PCR扩增与测序PCR反应扩增体系：10×缓冲液 2.5μl，dNTP 1μl， 引物各 1μl，EX Taq 聚合酶0.2μl， 模板 DNA 1μl，ddH2O 18.3μl。 PCR 反应条件：94℃预变性 5min，94℃变性 45s，53℃退火 30s，72℃延伸1min，35个循环，最后再72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物送华大生物技术有限公司进行双向测序。

2 结果

2.1 2016-2018年分别在满洲里和重庆口岸鼠类监测捕获活鼠搜检鼠体寄生螨类，共检获各类螨类185只，各口岸鼠类携带蜱类情况如表2。鼠类平均带螨率为30.77%，鼠类带螨率最高的为满洲里，为35.42%，最低为湖北宜昌口岸，为12.5%。但检获的螨大部分为若螨，部分螨形态学结构如图2所示。

表2 各口岸鼠类携带螨类情况

2.2 螨类分子鉴定

共提取8组螨类核酸，分别扩增ITS2，Cytb，COⅠ等基因部分片段。仅有COⅠ基因能获得特异性片段，其中3组测序成功获得特异性序列。将测序获得的序列与GenBank中其他螨类的COⅠ基因序列进行Blast比对，形态学鉴定为毒厉蟎的螨类与螨类Laelaps muricola （鼠尾厉螨）COⅠ基因KU166775同源性较高，同源性为89.3%；形态学鉴定为柏氏禽刺螨的螨类COⅠ基因与已知的柏氏禽刺螨Ornithonyssus bacoti COⅠ基因FM179677同源性100%。形态学未鉴定到种螨类COⅠ基因分别与已知的螨类COⅠ基因同源性均较低，与相似度最高的Pachylaelapidae sp的COⅠ基因同源性为77%。

图1 螨类COⅠ基因片段扩增结果

图2 螨类形态及序列分析

3 讨论

3.1 本研究对鼠体寄生螨进行了分子鉴定研究，并成功获得3种螨类COⅠ基因序列，但目前数据库中螨类COⅠ基因序列数量较少，比对分析较困难。需要进一步积累螨类分子鉴定序列数据。

3.2 螨类数量还需要进一步扩大。因时间关系采集螨主要集中在满洲里和重庆口岸，种类较少且单一，需进一步扩大采集口岸，使数据更具有代表性。

3.3 本研究采集螨类时间跨度长，标本运输保存可能影响了核酸质量，8组螨核酸仅有4个样本扩增获得了COⅠ基因特异性条带（图1），且其中只有1个样品电泳条带较亮。核酸质量可能也影响了其他基因扩增效率。进一步优化螨类标本筛检和核酸提取，可以提高螨类分子鉴定的成功率和特异性。