SRB的分离筛选及其去除废水中硫酸盐的响应面优化

蔡晓阳，张艳萍，焦凡凡，张丽媛

（北京工商大学轻工科学技术学院，北京100048）

近年来，随着我国食品加工、制药、化工、造纸等行业的迅速发展，产生了大量含高浓度硫酸盐工业废水〔1〕。如果直接排放会对人体健康和环境造成严重污染。硫酸盐还原菌（SRB）作为一种形态多样的厌氧微生物，在厌氧条件下，可以利用硫酸盐作为电子受体氧化简单的有机化合物并生成硫化物，这样不仅可以有效去除废水中的硫酸盐，其生成的硫化物还可以和废水中的金属离子反应形成不溶性金属硫化物，从而有助于同时从废水中去除硫酸盐和重金属〔2〕。

影响SRB去除废水中硫酸盐的因素有很多，例如，当初始pH从中性（pH=7.6）升高至 8.6～9.0时，SRB 的活性降低了 30%～50%〔3〕。 Fe2+质量浓度和COD/SO42-（C/S比）也是影响SRB去除废水中硫酸盐的两个重要因素。铁元素是SRB细胞中与硫酸盐还原相关的多种功能酶的辅基成分，有研究表明，Fe2+可以刺激SRB中含铁功能酶的活性〔4〕。C/S比是硫酸盐还原过程的关键性因素〔5〕，是影响SRB新陈代谢过程的重要参数，同时也涉及到含硫酸盐废水处理过程中的碳源保障问题。许多研究已经报道了初始pH、Fe2+浓度、C/S比对SRB生长情况和其去除废水中硫酸盐的影响〔1，6〕，但没有考虑到这些因素的相互影响。因此，本研究采用响应面法研究了这三个关键因素的交互作用，以期最大限度地提高废水中的硫酸盐去除率，为SRB处理含硫酸盐废水的工程应用提供一定的理论基础和指导作用。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

样品取自山东某食品公司处理柠檬酸废水的IC反应器中的厌氧颗粒污泥。

1.2 培养基

富集培养基（液体培养基）：采用改进的PostgateC 培养基，主要成分：KH2PO40.5 g，NH4Cl 1 g，Na2SO40.5 g，CaCl20.1 g，MgSO4·7H2O 1 g，70%乳酸钠5 mL，酵母膏0.5 g，1 000 mL去离子水，pH为6.5。在0.1 MPa，121℃下灭菌30 min。另用无菌水配制25 g/L的FeSO4·7H2O和5 g/L的抗坏血酸溶液，使用前分别用0.22μm滤膜过滤除菌后，在每100 mL培养基各加入2 mL，此时，两者在培养基中对应的质量浓度分别为0.5 g/L和0.1 g/L，其中的Fe2+质量浓度约为 185.00 mg/L〔7〕。

分离培养基（固体培养基）：在富集培养基的基础上添加2%的琼脂粉。

1.3 SRB富集

取10 g厌氧颗粒污泥于装有90 mL无菌水和玻璃珠的锥形瓶中，在恒温摇床内振荡培养1 h，取出后静置30 min，按接种比为10%取上清液接种于富集培养基中，为了保证严格的厌氧环境，用高纯氮气氮吹5 min，然后用双层封口膜封口，将其置于35℃，150 r/min的恒温摇床内培养，观察培养基变化情况，当培养基变成黑色，且用润湿的乙酸铅试纸置于瓶口检测有大量H2S生成时，说明SRB已大量富集，按1%的接种比转接到新配制的液体培养基中，共转接5次，然后对其进行分离纯化。

1.4 SRB分离筛选

取 0.2 mL 稀释度分别为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的前期富集的SRB菌悬液，按照稀释涂布-叠皿夹层法于分离培养基中培养，培养3～4 d后，平皿上长出的黑色小菌落即为SRB，挑取形态不一的单个菌落分别进行平板划线，并将其放入厌氧袋中培养，然后将挑选分离出的单个菌落接入液体培养基进行厌氧培养，如此重复进行即可获得纯菌株。对分离纯化的SRB进行初步筛选，在相同的培养条件下根据培养过程中各个液体培养基变黑的速度和硫酸盐去除情况确定后续实验研究菌株。

1.5 指标测定方法

硫酸盐浓度采用硫酸钡比浊法〔8〕进行测定，COD采用快速消解分光光度法测定〔9〕，pH采用AS600型便携式pH计进行测定。

按照1%的接种比，将液体培养24 h的SRB菌液接种于按照实验设计配制好且经过高温灭菌处理后的液体培养基中，置于35℃、150 r/min的恒温培养箱中振荡培养48 h，每个样品均设置2个平行，取培养好的菌悬液于50 mL离心管中，在11 000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定硫酸盐浓度，计算SRB的硫酸盐去除率=（空白液体培养基的硫酸盐浓度-接种液体培养基的硫酸盐浓度）/空白液体培养基的硫酸盐浓度×100%。

2 实验设计

2.1 单因素实验

2.1.1 初始pH的影响

将所筛选出的优势SRB，液体培养24 h后按1%的接种比接种于C/S比为3、Fe2+质量浓度约为185.00 mg/L的液体培养基中，用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液将初始 pH 分别调至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，氮吹 5 min，封口膜封口，置于 35 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养，每组做2个平行，48 h后取样测定废水中硫酸盐的去除率。

2.1.2 C/S比的影响

将所筛选出的优势SRB，液体培养24 h后按1%的接种比接种于初始pH为6.5、Fe2+质量浓度约为185.00 mg/L的液体培养基中，本研究通过保持液体培养基初始硫酸盐浓度不变，在液体培养基中加入不同质量的乳酸钠，进而调节培养基中COD，使C/S比分别为 0.5、1、2、4、6，氮吹 5 min，封口膜封口，然后置于35℃、150 r/min的恒温摇床中培养，每组做2个平行，48 h后取样测定废水中硫酸盐的去除率。

2.1.3 Fe2+浓度的影响

将所筛选出的优势SRB，液体培养24 h后按1%的接种比接种于初始pH为6.5、C/S比为3的液体培养基中，通过在培养基中加入不同体积的FeSO4溶液（25 g/L），使 Fe2+质量浓度分别为 0、92.50、185.00、277.50、370.00 mg/L（为了减少FeSO4浓度的增减对体系中硫酸盐浓度带来的影响，特通过调节MgSO4的浓度来保证体系中的C/S比不变，此时Mg2+浓度的变化影响忽略不计），氮吹5 min，封口膜封口，置于35℃，150 r/min的恒温摇床中培养48 h，每组做2个平行，48 h后取样测定废水中硫酸盐的去除率。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面优化实验条件

采用Design-Expert8.0 6.0软件设计响应面实验方案，根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，结合单因素实验结果，设计三因素三水平响应面分析实验。将所得数据进行二次方程回归拟合，建立数学模型，用回归方程的决定系数和校正系数来判断数学模型的拟合程度〔10〕，同时研究不同因素间的交互作用，并确定筛选出的优势SRB对废水中硫酸盐去除的最佳条件。

2.2.2 模型的验证

在响应面法分析得到的预测最优硫酸盐去除条件下，将所筛选出的优势SRB置于35℃、150 r/min的恒温摇床中培养，48 h后取样测定废水中的硫酸盐去除率，进行3次重复实验，最后将所得结果与模型的预测值进行比较，验证其可靠度和有效性。

3 结果与分析

3.1 SRB的富集培养与分离

从处理柠檬酸废水的IC反应器中的厌氧颗粒污泥共分离出3株SRB，分别命名为SRB-1、SRB-2、SRB-3。因为SRB在液体培养基中可以还原硫酸盐生成H2S，其能与Fe2+反应生成硫化亚铁黑色沉淀，故结合3个菌株液体培养基变黑的速度以及液体培养48 h后的硫酸盐去除率作为优势SRB的筛选指标，结果见表1。

表1 优势SRB的筛选

由表1可知，SRB-1使培养基变黑的速度最快，说明SRB-1生长代谢快，培养48 h后，该菌株对废水的硫酸盐去除率最高，达到了93.91%。所以将SRB-1作为后续实验的菌株。通过观察，SRB-1在固体培养基上菌落形态呈圆形隆起，直径约0.5～1 mm，不透明，质地较软，湿润，边缘整齐。在添加Fe2+的固体培养基上培养时为黑色，不添加Fe2+时为白色。其可以利用乳酸钠、乙酸、丙酸、柠檬酸作为电子供体还原硫酸盐，不能利用葡萄糖。过氧化氢酶呈阴性，在油镜下观察SRB-1形态，呈短杆状，革兰氏染色为阳性。

3.2 单因素实验

3.2.1 初始pH的影响

在不同初始pH条件下，考察SRB-1对废水中硫酸盐的去除效果，结果见图1。

图1 初始pH对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响

由图1可知，整体上，随着初始pH的不断升高，SRB-1对废水中硫酸盐的去除率呈先上升后缓慢下降的趋势。当初始pH为4.0时，硫酸盐去除率为0，同时在实验过程中观察到菌株液体培养液没有变黑，说明在强酸性条件下SRB-1难以对废水中的硫酸盐进行还原，较低的pH影响了SRB-1硫酸盐还原酶的性质，从而抑制了其生物代谢活性。当初始pH上升至5.0时，SRB-1对废水中的硫酸盐去除率提高到了54.54%，说明筛选出的SRB-1能够适应偏酸性的环境，可利用其去除偏酸性含硫酸盐废水中的硫酸盐。当pH在4.0～7.0之间时，废水中的硫酸盐去除率逐渐增大，主要是因为pH的增大促进了SRB-1体内相关酶的活性和稳定性，改变了细胞膜电荷的变化。当初始pH为7.0时，废水中的硫酸盐去除率最高，故本实验所筛菌株去除废水中的硫酸盐最优初始pH为7.0。这与杨春璐等〔11〕所筛出的SBR菌株BQ1的生长最适pH一致。

3.2.2 C/S比的影响

考察了C/S比对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响，结果见图2。

图2 C/S比对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响

由图2可知，不同C/S比下SRB-1对硫酸盐的去除效果不同。从整体上看，当C/S比为0.5～4时，硫酸盐去除率逐渐增大，比值为4时，硫酸盐去除率达到最大，为93.44%。当C/S比为0.5时，硫酸盐去除率最低，仅为7.93%。这是因为SRB-1属于异养微生物，根据其还原硫酸盐的代谢机理，环境中的碳源在满足SRB-1自身生长的同时，也要作为电子供体对硫酸盐进行还原，理论上SRB完全还原硫酸盐需要的C/S比为0.67。所以当C/S比较低时，碳源不足使得SRB-1硫酸盐代谢比较缓慢，故其对硫酸盐的去除率也较低。同时C/S比为6时，硫酸盐去除率为92.29%，比C/S比为4略有降低，所以本实验所筛菌株去除废水中硫酸盐的最佳C/S比为4。

3.2.3 Fe2+质量浓度的影响

考察了Fe2+质量浓度对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响，结果见图3。

图3 Fe2+质量浓度对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响

由图3可知，当培养基内不添加Fe2+时，硫酸盐去除率最低，为48.51%，随着Fe2+质量浓度的不断增大，硫酸盐去除率逐渐增大，说明Fe2+的投加明显提高了硫酸盐去除率，这与R.Marchal等〔12〕的研究结果一致。SRB-1属于一种厌氧微生物，添加具有还原性的Fe2+可以有效降低反应体系中的氧化还原电位（ORP），从而保证和维持SRB-1生长所必须的厌氧条件，促进SRB-1的生长代谢过程，提高其去除硫酸盐的性能。此外，废水中的Fe2+会和硫化物结合生成硫化亚铁沉淀，从而减弱所生成的硫化物对硫酸盐还原过程的抑制作用，同时也减轻了硫化氢对SRB-1的毒害作用，有利于SRB-1对硫酸盐的去除〔13〕。硫酸盐去除率在Fe2+质量浓度277.50～370.00 mg/L的变化幅度很小，Fe2+质量浓度为277.50 mg/L时硫酸盐去除率最大，达到了95.69%。

3.3 响应面实验

3.3.1 响应面模型的建立和显著性检验

结合单因素实验结果，选择C/S比、初始pH和Fe2+质量浓度为响应自变量，分别记为A、B、C，采用Box-Benhnken设计三因素三水平的响应面分析实验。响应面分析因素及水平见表2。优化实验设计与结果见表3。

表2 响应面分析因素及水平

表3 响应面优化实验设计与结果

利用Design-Expert 8.0 6.0软件对表3中的实验数据进行多元回归拟合，建立以硫酸盐去除率为响应值的多元线性回归预测模型：硫酸盐去除率=95.95+7.60A-3.62B+2.29C+0.45AB-1.06AC+9.24BC-19.14A2-23.12B2-16.02C2，对该模型方程进行方差分析和显著性检验的结果见表4。

由表4可知，C/S比、初始pH以及Fe2+质量浓度对SRB-1去除废水中的硫酸盐有较大影响。该模型的F值=739.71，P值＜0.000 1，回归模型极显著；方程的失拟项P值为0.076 5＞0.05，不显著，说明该模型在整个回归区域的拟合度很好，接近响应曲面的真实情况，模型建立合理。模型的决定系数（R2）=0.998 9，校正系数（Adj R2）=0.997 6，表明预测值和实际值的相关性较高，可以解释出99.76%的响应值变化，实验误差小。此外，变异系数（CV）可以用来表示模型的精确度，一般来说，CV值越低，模型的可信度越高，CV小于10%都是合理的，本实验模型中的CV=1.43%，说明所建立的模型精确度高，实验可信。可以利用该回归模型对响应值硫酸盐去除率进行预测，从而确定SRB-1去除废水中硫酸盐的最佳条件。

表4 二阶回归模型方差分析和显著性检验

3.3.2 响应面分析

在响应面分析中，响应曲面越陡峭，则该因素对响应值的影响越显著。等高线形状越接近椭圆，则两因素间交互作用越强，等高线形状为圆形时则表示两因素之间交互作用较弱〔14〕。考察C/S比、初始pH、Fe2+质量浓度三个变量以及两两交互作用对SRB-1去除废水中硫酸盐效果的影响，结果见图4。

由图4（a）可知，响应曲面比较陡峭，结合表3结果，这两个因素（A和B）的P值均小于0.000 1，表明初始pH、C/S比均可以对SRB-1去除废水中的硫酸盐产生极显著影响。同时因为一次项A的回归系数大于B，所以C/S比对硫酸盐去除率的响应较大。此外，初始pH和C/S比之间的交互作用并没有对硫酸盐去除率产生显著影响。这是因为由响应面所形成的等高线图近似圆形，且交互项AB的P值为0.388 6，大于0.05，未达到显著水平。当初始pH和Fe2+浓度一定时，废水中的硫酸盐去除率随着C/S比的增大呈先上升后下降的趋势，当C/S比和Fe2+浓度一定时，废水中的硫酸盐去除率随着pH的增大先上升后下降，这跟单因素实验结果一致。

图4 各影响因素的响应曲面图和等高线图

由图4（b）可知，响应曲面较为陡峭，等高线图接近圆形。结合表3结果，这两个因素（A、C）的P值均小于0.000 1，说明C/S比和Fe2+质量浓度对废水中的硫酸盐去除率影响显著，同时因为一次项A的回归系数大于C，所以C/S比对硫酸盐去除率的响应比较大。结合对回归方程系数的显著性检验，交互项AC的P值为0.066 6，大于0.05，表明两者之间的交互作用比较弱，没有对硫酸盐去除率产生显著影响。

由图4（c）可知，响应曲面较为陡峭，表明初始pH、Fe2+质量浓度均可以对SRB-1去除废水中的硫酸盐产生显著影响，且两者之间的交互作用比较强，（等高线图接近椭圆形）。同时结合表3结果，交互项BC的P值小于0.000 1，说明当C/S比一定时，初始pH和Fe2+质量浓度之间的交互作用对废水中硫酸盐去除率的影响是显著的。由等高线图可知，在C/S比一定的条件下，初始pH为8.5时，硫酸盐去除率随Fe2+质量浓度的增大而增大。pH决定着游离H2S在总硫化物（HS-+H2S）中的比例〔15〕，Fe2+是 SRB 细胞中各种酶的活性基组分，在细胞内通过自身价态转化（Fe2+⇌Fe3+）实现所在酶电子传递的作用〔16〕。 当pH大于7时，硫化物的存在形态主要是HS-，溶液中硫化物的含量增加，其可以与水中的Fe2+结合，当水中Fe2+质量浓度较低时，会导致SRB-1体内电子传递系统失活〔17〕，间接抑制微生物的活性，所以适量提高Fe2+质量浓度有助于废水中硫酸盐的去除。

此外，3个响应面图均为开口向下的凸形曲面，表明实验结果有极大值。同时，由等高线图可知，最大值落在了所设计的实验范围内，且回归方程存在极值的条件应该在圆心处。利用Design-Expert 8.0 6.0软件计算得出预测最优条件为：初始pH为6.9、C/S比为4.39和Fe2+质量浓度为281.72 mg/L，此条件下SRB-1对废水中的硫酸盐去除率最高，达到96.87%。考虑到实验过程中操作的便利，将最佳的硫酸盐去除条件修正为初始pH为6.9、C/S比为4.4、Fe2+质量浓度为281.72 mg/L。

3.3.3 验证实验

为了验证模型预测的准确性及响应面优化的SRB-1对废水中硫酸盐的去除效果，用修正后的条件做3次重复实验。实验结果分别为96.87%、96.79%、96.78%。平均值为96.81%，所得实验结果与预测结果基本一致。与验证实验结果比较，采用响应面优化得到的硫酸盐去除条件准确可靠，具有实用价值。

4 结论

（1）从处理柠檬酸废水的IC反应器中的厌氧颗粒污泥富集培养，分离纯化得到1株可以高效去除废水中硫酸盐的菌株SRB-1。SRB-1对硫酸盐的去除效果受初始pH、C/S比、Fe2+质量浓度的影响。单因素实验表明，当初始pH为7.0，C/S比为4，Fe2+质量浓度为277.50 mg/L时可以获得较好的硫酸盐去除效果。

（2）在单因素实验的基础上，利用响应面法对SRB-1去除废水中硫酸盐的条件进行了优化，建立了硫酸盐去除率与初始pH、C/S比和Fe2+质量浓度3个因素的二次多项式回归模型，通过方差分析及因素间的交互作用分析可知，回归模型的R2=0.998 9，Adj R2=0.997 6，在研究范围内拟合效果较好；C/S比对硫酸盐去除率的影响较突出，初始pH和Fe2+质量浓度之间的交互作用比较显著，P值均小于0.000 1。

（3）SRB-1 在初始 pH 为 6.9、C/S 比为 4.4、Fe2+质量浓度为281.72 mg/L的最优化条件下去除废水中硫酸盐时，SRB-1在培养48 h后对硫酸盐的去除率可达96.81%，与预测结果96.87%基本一致。表明该回归模型预测能力良好，得到的优化条件准确可靠，具有实用价值。