番茄灰霉病拮抗菌的筛选及其抑制作用研究

王继元

（天津农学院园艺园林学院，天津 300000）

1 引言

番茄（Lycopersicon esculentum Mill，茄科）又名西红柿 ，，作为世界上蔬菜需求中最多的菜品之一，在世界市场上有广泛的消费群体[1]。同时也是我国重要的经济作物，因其独特的风味，极高的营养价值，在日常生活中，番茄也可当水果食用[2]。

1.1 番茄灰霉病研究状况

番茄灰霉病（Botrytis cinerea）是令番茄减产的重要病害之一， 特别是早春大棚栽培的番茄， 因常遇低温高湿的天气，导致病害严重发生[3]。随着现代塑料大棚蔬菜生产的迅速发展，保护地蔬菜栽培面积的不断扩大， 此类病害逐年上升， 每年减产20 %- 30 %，严重时可达50 %。

1.1.1 番茄灰霉病主要病原菌、发病症状和致病因素

番茄灰霉病病原为真菌门（Eumycophyta），半知菌亚门（Deuteromycotina）， 丝 孢 纲（Hyphomycetes）， 丛 梗 孢 目（Moniliales），丛梗孢科，葡萄孢属（Botrytis cinerea）的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

番茄灰霉病发病症状为：番茄部分叶、茎、果实都出现病害。叶片的发病部位成灰褐色“V” 字形病斑，表面生有灰白色的霉层；茎部多发生在分枝处或基部，有水渍状斑点或淡褐色大斑，严重的绕茎一周，病枝折断；果实腐烂，密生灰色霉层，传播速度快，烂果很多[5]。

1.1.2 番茄灰霉病的防治

国内外学者十分重视番茄灰霉病的防治工作，并做了大量系统的研究[7]，并且在实践中已取得了一定的进展。但是，目前生产上仍然缺乏防治该病的有效办法。现在主要使用的防治手段有化学用药、物理防治和生物防治。化学用药可分为预防用药以及治疗用药；物理防治包括种子臭氧灭菌处理、大剂量臭氧空棚灭菌和采用RTBF-300 病害防治机；生物防治主要利用拮抗微生物对番茄灰霉病发生前进行防治[6]。

1.2 拮抗菌的应用及现状

拮抗菌能够产生一些拮抗物质，比如细菌素等，这些产生的物质能够抑制或者直接杀死病原微生物。拮抗菌抑制病原微生物的重要机理之一是其具有抗生作用。目前，抗生素的应用比较广泛，对黄瓜疫病、泡桐腐烂病、杨树烂皮病和白菜霜霉病等病害有较良好的防治效果。

1.3 本试验的目的和意义

番茄是世界蔬菜需求量最多的菜品之一，同时也是我国重要的经济作物之一。番茄灰霉病会直接导致番茄产量的锐减，利用生物防治手段来防治番茄灰霉病的发生，有利于生态环境的保持以及农业的可持续发展，因为生物防治手段是通过利用微生物中具有的拮抗作用来抑制有害菌类发生，由于利用拮抗作用来防治病害几乎不产生副作用，不污染环境，所以利用拮抗菌进行生物防治具有较大的应用潜力。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 土壤样品采集

本试验所使用10 个不同地区所采集的土壤样品，进行番茄灰霉拮抗菌的筛选。

2.1.2 试验主要试剂及仪器

LB 培养基：

蛋白胨 10 g 酵母粉 5.0 g 氯化钠（NaCl） 10 g

蒸馏水 1000 ml PH 7.5

混匀后每支试管加入5ml（固体LB 需每100ml 添加1.6g琼脂粉末）121 ℃高压灭菌20min

（1）PDB 培养基：

新鲜马铃薯 200g 蔗糖 20.0g 蒸馏水 1000ml

混匀后（PDA 培养基需每100ml 添加1.6g 琼脂粉末）121 ℃高压灭菌20 min

（2）察氏培养基：

硝酸钠（NaNO3） 3.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0 g

七水硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5 g 氯化钾（KCl） 0.5 g

硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 0.01 g 蔗糖 30 g

混匀后121 ℃高压灭菌20 min。

2.2 试验方法

2.2.1 试验样品菌株的分离与纯化

采集不同地区新鲜土样10 份，采集时注意采集根际土壤，将不同地区采集图样标记编号。取各编号土样1 份，进行研磨，至土样细腻为止，过400 目筛子，取筛后土样各0.5 g，溶于含50 ml 0.85 % 生理盐水的锥形瓶中，用封口膜封上并将其置于180rpm/min 37℃的摇床上20min（使土壤中微生物充分溶于生理盐水中）。

2.2.2 番茄灰霉病拮抗菌的筛选

将得到的差异菌株，与番茄灰霉病病菌进行平板对峙培养试验。在固体PDA 平板培养基中心接种番茄灰霉菌饼，在四周对称接种所筛选出的差异菌株（每组三次重复），每个平板可以接4-6 个点（可接差异菌株），置于真菌培养箱培养，观察是否存在抑菌圈，筛选出对番茄灰霉具有较明显拮抗作用的菌株，再单独进行对峙培养。

2.2.3 番茄灰霉病拮抗菌形态的观察

相同培养基在相同的培养条件下，不同菌种的生长特性是各自不同的，因此根据菌落的形态、颜色以及生长时间来鉴定菌种。试验过程中，我们沾取新长出的细菌的菌体画线接种于LB 培养基中；真菌挑取菌丝用划线法接种在PDA 培养基中，将其分别置于细菌培养箱（29 ℃）和真菌培养箱（25 ℃）中培养，并观察菌落的特征形态，记录数据。

2.2.4 番茄灰霉病拮抗菌的分子鉴定

使用北京索莱宝科技有限公司生产的细菌基因组DNA 提取试剂盒按照说明步骤进行了细菌株基因组的提取，并将提取所得DNA 模版进行电泳检测。

2.2.5 番茄灰霉拮抗菌的生理生化鉴定

2.2.5.1 唯一碳源利用

选取草酸、半乳糖、核糖、L-树胶醛糖、淀粉、肌醇、精氨酸、柠檬酸、蔗糖、木糖、麦芽糖、甘露醇、D- 海藻糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇、鼠李糖、果糖、糖原等药品进行碳源利用试验。

2.2.5.2 糖、醇发酵产酸

选取木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、L- 树胶醛糖、淀粉、蔗糖、D- 海藻糖、肌醇、果糖、麦芽糖、等药品进行试验。

2.2.5.3 精氨酸双水解酶

培养基：蛋白质 1.0 g；酚红 0.01 g；NaCl 5.0 g；琼脂 6.0 g；L- 精氨酸盐 10.0 g；K2HPO40.3 g；蒸馏水 1000 ml

调节PH 到 7.0-7.2 之间，分装试管（每支试管5 mL），建立对照组，121 ℃下灭菌20 min。

3 结果与分析

3.1 试验土壤样品中菌株分离、纯化

经过对土样的分离及纯化，从10 份土壤样品中分离出差异菌株29 株，其中细菌25 株，真菌4 株，依次对其进行编号。细菌为：WJY-1 至WJY-25；真菌为WJY-Z1 至WJY-Z4。

3.2 番茄灰霉病拮抗菌的筛选

通过与番茄灰霉病菌对峙培养试验，筛选得到6 株（编号依 次 为：WJY-1，WJY-2，WJY-3，WJY-7，WJY-8，WJY-9）有拮抗作用的细菌。注：“＋” 代表阳性，“－” 代表阴性。

4 讨论

4.1 番茄灰霉病拮抗菌的筛选

因为使用化学手段对番茄灰霉病进行防治，会产生大量的药物残留，破坏生态环境等一系列问题。但是使用拮抗细菌进行防治几乎不会产生这些问题，因此对拮抗菌的研究与应用已成为目前研究热点之一。芽孢杆菌是目前拮抗菌研究的主要菌属之一，其种类繁多，对外界环境具有极强的适应能力，并可产生抗逆性的芽孢，在其代谢物质中有多种的活性抑菌物质存在，具有较大的抑菌范围，对部分农作物有一定的促生作用，具有良好的应用前景。

4.2 菌种鉴定

传统的微生物鉴定手段，主要是通过形态学观察结合生理生化试验结果对细菌进行初步鉴定。但由于微生物种间的差异有时并不显著，而且在不同的生存环境下，相似的菌类一样可能产生不同的生长现象，从而导致不同的生理生化现象，这就造成菌种鉴定中存在误差。随着现代的分子生物学的发展，可以进一步削弱此类问题。

4.3 筛选所得拮抗菌抑病效果

拮抗菌的作用机理较为复杂，其与环境因素存在紧密的关系，当外界环境不适于其生长时，甚至都不会表现出其拮抗作用甚至死亡。在试验室充足的环境条件下单一菌株也会存在易退化现象，单一菌株对环境适应能力较弱，在不同的环境中往往并不能表现出试验室内的试验结果以及现象。

5 结论

在我国，番茄灰霉病可导致番茄每年减产20 %-30 %，已经成为番茄种植过程中面临的重大问题之一。在蕃茄灰霉病防治过程中，由于拮抗菌防治病害专一性强，无毒害，无污染已在世界范围广泛使用。