花椒提取物对嗜水气单胞菌群体感应的抑制作用

李 晴，许腾腾，张佳慧，赵慧娟，刘尊英

(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

群体感应(quorum sensing,QS)是一种细菌之间沟通交流及传递信息的方式，此机制普遍存在于革兰氏阴性菌与阳性菌中,当外界环境中细菌分泌的信号分子积累到一定阈值时，便会与细菌体内特异性受体相结合，被细菌感知，从而启动细菌相关基因表达，调控细菌的相关性状[1]。相关研究表明，致病菌毒力因子的表达及腐败菌的相关腐败特性，如生物被膜的形成、胞外蛋白酶、嗜铁素的产生等均依赖于QS系统的调控[2-3]。近年来，相关研究表明很多食品腐败均与其腐败菌QS密切相关，如Zhu等[4]研究表明特定腐败菌波罗地海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)可通过窃听周围环境中的N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)调控腐败特性的表达，加快冷藏凡纳滨对虾的腐败，Christensen等[5]发现SerratiaproteamaculansB5a的sprl基因(参与AHLs合成)缺陷株不能导致牛奶腐败，而外源添加AHLs时又恢复了其致腐能力。群体感应抑制剂(QSIs)指不影响细菌正常生长却能干扰或抑制细菌间信息交流的物质[6]。QSI可在减少细菌耐药性产生的前提下有效降低细菌的致腐性与致病性。目前，天然来源的QSI安全且毒性小，成为国内外学者研究的热点。Cosa等[7]研究发现，来源于果蔬及香辛料的多酚类、黄酮类及萜类等小分子活性化合物均有群体感应抑制作用，芹菜所含的一种3-正丁基-4,5-二氢邻苯二甲酸酯活性化合物能显著抑制紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026紫色色素产量，具有QS抑制作用。薄荷油中的薄荷醇降低了依赖于AHLs的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)及铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)毒力因子和生物膜的形成，具有广谱QS抑制活性[8]。

花椒，属芸香科落叶小乔木，是一种传统的中药与调味香料，其绿色安全、价格较低，被广泛应用于食品及医药领域[9]。花椒主要化学成分为挥发油、酰胺、生物碱等[10]。花椒具有良好的抗菌、抗氧化作用，可用于肉制品的保鲜，但其QS抑制活性却鲜有报道[11]。研究花椒提取物的群体感应抑制活性，可为进一步开发利用花椒提供依据。嗜水气单胞菌属气单胞菌属，是一种革兰氏阴性菌，在自然界尤其水中广泛分布，能够产生外毒素，是常见的致病菌和腐败菌之一[12]。随着水产品保鲜领域研究报道的增多，嗜水气单胞菌致腐性逐渐受到关注。于红雷等[13]从冷藏凡纳滨对虾中分离并鉴定出1株嗜水气单胞菌，并发现其具有分泌C4-HSL的能力。此外，外源添加信号分子可通过增强QS从而提高其蛋白酶活性。李学鹏等[14]研究发现嗜水气单胞菌嗜铁素的产生及蛋白水解活性等腐败特性的强弱均与QS有关，且加入丹皮提取物可有效减少AHLs产生从而减弱其致腐能力。

本文中，笔者以花椒提取物为研究对象，制备并探讨其QS抑制活性及其对嗜水气单胞菌生物被膜、蛋白酶活性、细菌泳动、信号分子产生的抑制效果，为基于群体感应抑制原理的天然保鲜剂开发提供理论依据与参考，同时进一步丰富和创新水产品贮藏保鲜理论。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花椒，购于青岛当地农贸市场；报告菌株紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026，美国德克萨斯州立大学McLean J C教授惠赠；目标菌株嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)从冷藏凡纳滨对虾中分离得到，保存于实验室。

N-己酰基-L-高丝氨酸内酯标准品(C6-HSL)、二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司；偶氮酪蛋白、卡那霉素、十二烷基硫酸钠、琼脂，Solarbio公司；LB肉汤、LB琼脂，青岛海博生物技术有限公司；其余试剂均购自国药集团试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒提取物的制备

原料花椒于40 ℃干燥箱烘干24 h，经粉碎机粉碎处理后过0.180 mm筛。取30 g粉末于500 mL烧杯中，按料液比为1∶ 12(g/mL)的比例加入无水乙醇，混合搅拌均匀。后利用超声波进行辅助提取，工作条件为功率180 W、温度50 ℃提取时间3 h。依次进行过滤、减压抽滤后得到提取液，用旋蒸法在45 ℃温度下进行浓缩。将得到的油状浓缩物置于4 ℃避光、密封保存。

1.2.2 抑菌活性及群体感应抑制活性检测

最小抑菌浓度检测:嗜水气单胞菌与紫色杆菌CV026过夜活化2次后，按体积分数2%接种量分别接种于新鲜 LB 液体培养基中(培养紫色杆菌CV026的LB肉汤中需含有20 μg/mL卡那霉素)。后在48孔透明酶标板中加入不同质量浓度的花椒提取物(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)，30 ℃培养24 h 后测定OD600。以添加体积分数2% DMSO的培养液作为阴性对照。因花椒提取浓缩物难溶于水，配制溶液前，先将其溶解于少量DMSO中，过0.22 μm无菌滤膜，试验时用无菌水或LB培养液稀释至所需浓度。为防止影响细菌正常生长，保证DMSO不超过2%。

群体感应抑制活性检测:经过活化的报告菌株紫色杆菌CV026按1%接入量接种于含有20 μg/mL卡那霉素的新鲜LB肉汤中，摇床培养约16 h。后吸取1 mL菌液与100 mL冷却至40 ℃左右的含有20 μg/mL C6-HSL LB半固体培养基混匀，倒平板。待凝固后用牛津杯打孔，分别加入100 μL亚抑菌浓度为1.0、2.0和4.0 mg/mL的花椒提取物，在28 ℃条件下培养1～2 d，观察紫色菌素的产生情况。以添加2% DMSO的培养液作为阴性对照。

1.2.3 紫色色素产量定量检测

报告菌株紫色杆菌CV026过夜活化后，以1%接种量接种于含亚抑菌浓度的花椒提取物(1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)加入200 μL的LB肉汤中(含有20 μg/mL C6-HSL)，160 r/min、30 ℃振荡培养48 h。将未添加花椒提取物的设为对照组。同时，不添加信号分子，将紫色杆菌CV026以相同接种量接种于不同浓度的LB肉汤中，相同条件下培养，测定紫色杆菌CV026生长情况。依次取200 μL添加信号分子实验组的培养液于1.5 mL离心管中，加入200 μL10%十二烷基硫酸钠，涡旋振荡5 s，室温下静置5 min，后加入900 μL饱和正丁醇(50 mL正丁醇与10 mL蒸馏水)，涡旋5 s,10 000 r/min离心5 min。收集含有紫色色素的上清液，测定OD595。以对照组紫色色素产量为100%，表示紫色色素相对产量。

1.2.4 花椒提取物对嗜水气单胞菌生物膜的影响

过夜活化的嗜水气单胞菌以1%体积分数接种于96孔板200 μL新鲜LB肉汤中，分别加入不同剂量的花椒提取物，使其最终质量浓度为1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，以加入相同剂量2% DMSO的培养液为阴性对照，30 ℃静置培养48 h。测定OD600后，去除培养液和浮游细菌，用无菌水轻轻冲洗3遍。然后自然干燥40 min，在室温下用250 μL 1 g/L结晶紫染色15 min，用无菌水洗涤3次去除多余染料，在空气中自然晾干40 min。后加250 μL 95%乙醇脱色5～10 min，吸取200 μL转移到新的酶标板中检测OD590。生物膜相对抑制率=(对照OD590-样品OD590)/对照OD590×100%。对照OD590和样品OD590分别为阴性对照和实验组测定的OD590。

1.2.5 花椒提取物对嗜水气单胞菌蛋白酶活性的影响

以偶氮酪蛋白为底物，取含有不同质量浓度(0、1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL)花椒提取物培养24 h的嗜水气单胞菌菌液，4 ℃、12 000 r/min离心5 min后得无菌上清。取400 μL细菌上清液，加入200 μL 20 mg/mL偶氮酪蛋白，混合均匀后，置于30 ℃水浴1 h后加入600 μL三氯乙酸(100 g/L)沉淀蛋白。对照组为加入偶氮酪蛋白水浴1h后，先加三氯乙酸沉淀，再加细菌上清，后离心处理。取500 μL上清液与等体积的NaOH(1 mol/L)混合，测定OD440吸光值。以对照组为100%，表示蛋白酶活力的相对强弱。

1.2.6 花椒提取物对嗜水气单胞菌泳动的影响

细菌泳动性测定参照文献[15]进行，向冷却至40 ℃的泳动琼脂培养基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl、3 g/L琼脂)中加入经0.22 μm滤膜过滤的花椒提取物，使其终质量浓度为1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL。以不加花椒提取物的菌液为阴性对照。充分混匀后倒平板，冷却后向平板中央滴加1 μL过夜活化的嗜水气单胞菌菌液，无菌风吹干，置于28 ℃恒温培养箱培养24 h，观察与测量移动直径。

1.2.7 花椒提取物对嗜水气单胞菌产信号分子的影响

AHLs信号分子提取：过夜活化的嗜水气单胞菌以1%体积分数接种于200 mL LB肉汤中，分别添加不同剂量花椒提取物，使其终质量浓度1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，未添加花椒提取物的液体培养基组作为阴性对照组。30 ℃、160 r/min振荡培养过夜，离心(4℃、12 000 r/min，5 min)，上清液用等体积乙酸乙酯(含0.5%甲酸)萃取，保留上层有机相，于35 ℃旋蒸。蒸干后，用1 mL甲醇润洗烧瓶。所得粗提液置于-20 ℃保存。

AHLs检测：将过夜活化的紫色杆菌CV026以2%体积分数与100 mL冷却至40 ℃ LB半固体培养基混合，同时加入卡那霉素(终质量浓度20 mg/mL)，倒平板。待风干后，打孔，加入30 μL AHLs粗提液。30 ℃培养过夜，观察是否有紫圈及紫圈直径大小。

2 结果与讨论

2.1 花椒提取物的抑菌活性及群体感应抑制活性

向培养液中添加不同浓度的花椒提取物，观察紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的生长情况，结果见图1。

由图1可知，嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为32.0 mg/mL，紫色杆菌CV026的最小抑菌浓度为8.0 mg/mL，后续试验均以花椒提取物的亚抑菌浓度进行。花椒提取物对嗜水气单胞菌的试验质量浓度为1.0、4.0、8.0和16.0 mg/mL，对紫色杆菌CV026的试验质量浓度为0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL。与对照组相比，添加不同浓度的花椒提取物后，圆孔周围均出现浑浊、不透明的紫色色素抑制圈，且抑制圈的直径随着提取物浓度的升高而增大。由此说明，花椒提取物在不影响菌株生长的情况下，对紫色杆菌CV026群体感应具有一定抑制作用，这种作用呈浓度依赖性抑制。

a—对照；b—1.0 mg/mL；c—2.0 mg/mL；d—4.0 mg/mL图1 花椒提取物对紫色杆菌CV026产紫色色素的抑制作用Fig.1 Inhibition of Z.bungeanum extract on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 紫色色素的定量检测

运用酶标法对紫色杆菌CV026紫色色素产量进行定量分析，其产量降低程度可表明花椒提取物的群体感应抑制活性强弱，结果如图2所示。由图2可知：在亚抑菌浓度下，花椒提取物对紫色杆菌CV026生长无抑制作用。随着花椒提取物浓度的升高，紫色杆菌色素产量呈浓度依赖性降低。当花椒提取物质量浓度为4.0 mg/mL时，紫色色素产量仅为对照产量的14.63%(P<0.05)。由此说明，在不影响菌株正常生长代谢的前提下，花椒提取物对紫色杆菌CV026的群体感应系统具有抑制作用。

图2 花椒提取物对紫色杆菌CV026紫色色素产量的影响Fig.2 Effects of Z.bungeanum extract on violacein production of C.violaceum CV026

2.3 花椒提取物对嗜水气单胞菌生物膜的影响

图3 花椒提取物对嗜水气单胞菌生物膜的影响Fig.3 Effects of Z.bungeanum extract on biofilm formation of A.hydrophila

生物膜是细菌在生长过程中吸附于生长基质表面形成的一种与浮游细胞相应的生物被膜，由菌体和自身分泌的细胞外基质构成[16]。生物膜形成有利于细菌生长及抗逆性产生。Chu等[17]研究表明群体感应是嗜水气单胞菌生物膜形成和毒力因子表达的重要调控机制之一。Rama等[18]发现迷迭香酸能有效抑制嗜水气单胞菌群体感应介导的生物膜形成和毒力因子产生。考察花椒提取物对嗜水气单胞菌生物膜的影响，结果见图3。由图3可知，在亚抑菌浓度下，花椒提取物对嗜水气单胞菌生长无明显抑制作用。以对照组为基准(生物膜相对抑制率为0)，随着花椒提取物浓度的升高，菌株生物膜抑制率呈浓度依赖性升高。当花椒提取物质量浓度分别为8.0和16.0 mg/mL时，其生物膜抑制率为48.48%、72.11%，差异达显著水平(P<0.05)。这表明，在不影响菌株正常生长代谢的前提下，花椒提取物能够抑制嗜水气单胞菌生物被膜的形成，且抑制效果呈浓度依赖型。由此推测，花椒提取物中含有某些QSI活性成分，可通过干扰该菌群体感应进一步抑制生物膜形成。

2.4 花椒提取物对嗜水气单胞菌蛋白酶的影响

嗜水气单胞菌可分泌胞外蛋白酶，将肉类、奶类食品中蛋白分解，造成食品变质腐败[19]。嗜水气单胞菌胞外蛋白酶活性的强弱与其本身的群体感应系统密切相关，通过调控QS可延缓相关食品腐败[20]。考察花椒提取物对嗜水气单胞菌蛋白酶的影响，结果见图4。由图4可知，与对照组相比，菌株胞外蛋白酶活性随着花椒提取物浓度的升高而降低，这与梅永超等[21]研究结果相似。当花椒提取物质量浓度分别为8.0和16.0 mg/mL时，其相对蛋白酶活性仅为最初的31.01%、26.70%,抑制效果显著(P<0.05)。

图4 花椒提取物对嗜水气单胞菌蛋白酶活性的影响Fig.4 Effects of Z.bungeanum extract on protease activity of A.hydrophila

2.5 花椒提取物对嗜水气单胞菌泳动的影响

泳动是细菌迁移的一种重要方式，指细菌在小于0.45%的琼脂培养基表面迁移[22]。Packiavathy等[23]研究发现，泳动有利于细菌生物膜的形成以及细菌在宿主表面的黏附聚集[23]。图5为不同花椒提取物用量对嗜水气单胞菌泳动能力的影响。由图5可知，添加花椒提取物的处理组泳动性明显弱于对照组，泳动直径显著减小，且泳动直径的大小与提取物添加量呈负相关。由此可见，花椒提取物能够显著抑制嗜水气单胞菌泳动性，阻碍菌株的迁移。

图5 花椒提取物对嗜水气单胞菌泳动性的影响Fig.5 Effects of Z.bungeanum extract on swimming motility of A.hydrophila

2.6 花椒提取物对嗜水气单胞菌产AHLs的影响

目前普遍接受的QSI的作用机制主要有3种：抑制信号分子合成、作为信号分子类似物，通过与受体蛋白结合竞争性结合抑制及直接降解信号分子[24]。香芹酮通过下调halI(AHL合成酶)基因的表达，减少信号分子产生，从而减弱H.alvei毒力因子表达[25]。槲皮素竞争性抑制信号分子与受体蛋白LasR或PqsE的结合，从而抑制细菌群体感应系统[26]。嗜水气单胞菌产C4-HSL 信号分子[13]。因此选用 CV026为报告菌株进行检测，结果见图6，以其紫色圈直径的大小可表示AHLs 的相对含量。

由图6可知，花椒提取物处理组的紫色圈直径均小于对照组，且呈现浓度依赖性。这表明，花椒提取物可通过减小AHLs产量调控细菌的群体感应系统，并进一步调控相关特性的表达。而花椒提取物中的活性成分能否与菌株信号分子受体结合或降解信号分子，仍需进一步探索。

图6 花椒提取物对嗜水气单胞菌AHLs产生的影响Fig.6 Effects of Z.bungeanum extract on AHLs production of A.hydrophila

3 结论

以紫色杆菌 CV026为研究菌株，证明了花椒提取物具有群体感应抑制活性，能显著抑制紫色杆菌CV026紫色色素的产生。花椒提取物可抑制嗜水气单胞菌生物膜形成、胞外蛋白酶活性及泳动作用，且抑制作用呈现浓度依赖性。花椒提取物显著降低嗜水气单胞菌AHLs的产生，推测花椒提取物可通过减少AHLs干扰嗜水气单胞菌的群体感应系统，从而调控相关性状的表达。本研究证实了花椒提取物的群体感应抑制活性，但目前花椒提取物所含的活性成分及其对腐败菌QS调控的分子机制尚不明确，仍需进一步研究，为其作为天然保鲜剂的开发奠定理论基础。