真菌的群体感应现象及群体感应分子(QSMs)研究进展

魏天予，牛永武，陈启和

(1.浙江大学 食品科学与营养系,浙江 杭州 310058；2.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450000)

长期以来，研究人员一直认为细胞间的信息交流仅存在于多细胞生物体内。20世纪70年代 Eberhard[1]发现环境中费氏弧菌(Vibriofisheri)菌群浓度达到一定阈值时即产生生物发光现象，引起研究者的关注。后来，研究人员在黄色粘液球菌(Myxococcusxanthus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、链霉菌属(Streptomycesspp)等多种细菌中均发现存在细胞间交流现象[2]。1994年，Fuqua等[3]首次提出了细菌群体感应(quorum sensing,QS)概念，是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性发生变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征。即通过分泌群体感应信号分子(QSM)或自诱导调节分子(AI)作为小扩散信号分子，与转录激活蛋白相互作用，将基因表达与细胞密度耦联在一起。

群体感应研究初期主要以细菌为研究对象，发现细菌群体感应系统通常由自诱导分子、感应分子及下游调控蛋白组成，对菌体形态、生物被膜形成、毒素分泌、生物发光等多种生理行为都具有调控作用[4]。目前，研究确定具有代表性的细菌群体感应系统有LuxI-LuxR型革兰氏阴性菌系统和寡肽介导的革兰氏阳性菌系统[5-6]。与细菌群体感应系统相比，对真菌群体感应系统的研究起步稍晚。近年研究发现，真菌可通过群体感应信号分子(QSM)介导菌相转化、毒素产生、孢子形成等生理行为。目前，已发现存在群体感应现象的真菌主要有白色念珠菌(Canidiaalbicans)[7]、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[8]、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)[9]、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)[10]、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)[11]、腐榆角藻菌(Ceratocystisulmi)[12]和辐射松白化菌(Ophiostomafloccosum)[13]等。在这些菌株中，围绕白色念珠菌的群体感应现象及机制研究报道较多，发现了其主要的QSM及其调控作用机制。

1 白色念珠菌(Canidia albicans)群体感应研究

白色念珠菌(又称白念珠菌，Canidiaalbicans)是一种多态性机会致病真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般不引起疾病，当机体免疫功能或防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，该菌开始大量繁殖并改变生长形态(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病[14]。因此，白色念珠菌是较早被报道具有群体感应系统的真菌之一，关于真菌群体感应系统调控机制及作用靶标等研究主要围绕该菌展开。

1.1 白色念珠菌的群体感应分子挖掘

20世纪70年代，研究人员发现白色念珠菌随时间和环境变化呈现出酵母、假菌丝、菌丝等多种形态，随后围绕不同培养基组分对其形态变化的影响展开研究，以芽管形成比例为指标，先后对羊血清、胰酶解酪蛋白大豆肉汤培养基、乙酰葡糖胺、硫酸镁、氯化锰、脯氨酸和生物素等物质进行研究后发现：羊血清、胰蛋白酶大豆肉汤、脯氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸等有利于白色念珠菌芽管的形成，而L-半胱氨酸、D-脯氨酸和一些脯氨酸结构类似物对芽管的萌发具有抑制效果[15-17]。Warnock等[18]研究白色念珠菌的接种浓度对芽管的形成作用，发现当菌体细胞密度低于106个/mL时，白色念珠菌主要为丝状生长，丝状菌体随细胞生长和密度升高逐步转变为酵母态生长。后期Brown等[19]研究发现，白色念珠菌菌体形态变化与人体致病感染具有密切关联：白色念珠菌感染人体初期细胞密度较低，以丝状形态生长，有利于其附着在机体表面，随着菌体生长和细胞密度升高逐步转变为酵母态，释放出毒力因子，从而引起人体感染。白色念珠菌的不同形态之间转变受到多种QSM的调控，已知的白色念珠菌群体感应分子主要有法尼醇(farnesol)、法尼酸(farnesoic acid)和酪醇(tyrosol)。

1.1.1 法尼酸和法尼醇

20世纪末，Bard等[20]和Cho等[21]通过多项研究确定白色念珠菌形成芽管的条件，揭示了抑制白色念珠菌芽管形成的群体感应分子部分理化性质，排除了茉莉酸酯作为白念珠菌QSM的可能性。2001年，Hornby等[22]通过总结前期工作，以6株白色念珠菌为研究对象展开群体感应现象研究，通过分离纯化、高效液相色谱、气相质谱联用、薄层色谱等系列方法鉴定并验证白色念珠菌中第一个群体感应分子——法尼醇(farnesol)，主要作用是抑制白念珠菌向芽管和丝状形态转变。

此外，在研究中总结出法尼醇作为群体感应分子的主要特点：①分泌到胞外并可在培养基中扩散，通过洗涤可以从细胞表面去除；②在菌体生长期间，其生成量与细胞干质量大致成正比；③实验中6个白色念珠菌菌株均可合成；④可以抑制3种不同化学因素(L-脯氨酸、N-乙酰葡糖和血清)介导的发芽管形成；⑤合成取决于细胞生长而不依赖于特定的碳源或氮源；⑥可以改变细胞形态，但不改变细胞的生长速率；⑦在细胞所有生长温度下均能产生，具有热稳定性[22]。同年，Oh等[23]通过正相和反相高效液相制备色谱提取和纯化白色念珠菌调控群体感应的物质，利用核磁共振和质谱法鉴定该物质的结构，发现其为3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯酸(法尼酸)；基于对菌体生长的影响验证研究发现，该物质不抑制酵母细胞生长，但能抑制丝状生长。

1.1.2 酪醇

Finkel等[24]研究发现白色念珠菌中另一个群体感应信号分子是对羟苯基乙醇(又称酪醇，tyrosol),主要作用是促进白色念珠菌从酵母状态到菌丝相的转变。研究发现，新接种白色念珠菌细胞密度低于107个/mL 时，出现一个明显的生长停滞期，初始菌体密度越低，其生长停滞期越长，主要是因为菌体细胞在被稀释后需要进行DNA 复制、染色体分离、细胞周期调整等，所以启动菌体细胞的重新生长需要有较长的停滞期，但向培养基中加入适量酪醇可明显缩短该停滞期。Martins等[25]通过比较基因组学方法研究酪氨醇处理对高密度培养白色念珠菌细胞基因转录的影响,发现低密度培养时，不加酪氨醇某些基因的表达量显著降低,但添加酪氨醇后这些基因表达量并未降低，分析发现这些基因所编码的蛋白主要参与了DNA合成、细胞周期调节等，这说明酪醇对于调整周期相关的基因表达有促进作用[26]。

1.2 白色念珠菌QSMs的其他生理效应

法尼醇、酪醇等白色念珠菌的QSMs被发现之后，一直作为病原真菌的研究热点受到持续关注。研究发现，白色念珠菌QSMs不仅调节自身芽管、菌丝态、酵母态等多种形态之间转变[27]，还具有多种生理学效应，如对生物膜的形成[28]、生物体的氧化应激[29-32]及其他微生物的生长代谢均具有调控作用[33-45]。

1.2.1 对生物被膜形成的影响

生物被膜是指细菌或真菌附着于宿主腔道或生物材料表面，分泌多糖基质、纤维蛋白或脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样多细胞复合体。许多研究发现，各种真菌耐药程度与生物被膜形成过程有关,而且由生物膜引起的人体疾病感染难以根除，因为其特殊结构对抗生素和宿主免疫因子有抗性[46]。白色念珠菌形成生物被膜过程中，细胞形态转变具有重要意义，因此白色念珠菌的QSMs对其生物被膜形成具有调控作用(图1)。

图1 白色念珠菌生物被膜的形成过程[27]Fig.1 Formation of Candida albicans biofilms[27]

Nickerson等[47]探究了法尼醇对生物膜发育的影响，发现法尼醇不仅抑制白色念珠菌向丝状转变而且抑制生物膜的形成，抑制效果与法尼醇加入时间有关。当白色念珠菌细胞开始向菌丝相转变后，添加法尼醇对生物膜形成没有影响，但成熟生物膜上的细胞对类异戊二烯有反应，这种效应可能对生物被膜的分散产生影响[28]。通过基因芯片方法检测白色念珠菌调控生物被膜基因表达信息发现，在处理条件下，法尼醇不仅与菌丝形成相关，使得基因发生显著变化，而且与耐药性、细胞壁形成、细胞表面亲水性、铁离子转运和热休克蛋白相关的基因表达也发生明显变化。将法尼醇与环孢菌素A(cyclosporin A，CSA)联合使用，发现其对白色念珠菌生物被膜具有明显抑制作用，与菌丝形成的相关基因(如CEK1、CPH1、EFG1、ERG11、GPR1、HAT1、HWP1、ALS3和TUP1)表达量均显著降低。法尼醇、氟康唑、两性霉素B或米卡芬净对白色念珠菌生物被膜形成均有抑制作用，将它们联合使用，发现抑制生物被膜效果增强，其中法尼醇和米卡芬净达到最大的协同作用[48]。

Alem等[48]发现白色念珠菌在37 ℃培养时，其生物被膜细胞也可以合成酪醇，合成量与生物被膜干质量相关，扫描电镜结果显示白色念珠菌生物膜形成的早期阶段加入酪醇可以刺激菌丝生长。同时加入法尼醇和酪醇，发现两者对生物被膜形成具有拮抗作用，50 μmol/L法尼醇的调节效果可以被高浓度酪醇(>100 μmol/L)所抵消；当法尼醇浓度增加到100 μmol/L时，只有1 000 μmol/L 浓度的酪醇可抵消其作用效果，但生物被膜中细胞多数为酵母状态，说明法尼醇在菌相转换方面的作用效果优于酪醇。迄今为止，法尼醇抑制白色念珠菌生物膜形成和酪醇对生物被膜的影响机制尚未完全阐明，所以其仍是白色念珠菌群体感应研究的热点之一。

1.2.2 对生物体氧化应激的影响

1.2.3 与其他微生物的相互作用

白色念珠菌的QSMs不仅介导种内群体生理行为变化，也介导种间甚至不同物种间的相互作用[33]。白色念珠菌通过法尼醇对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)和多种曲霉等微生物的不同生理效应产生影响，从而在多物种竞争生长中获得优势。

白色念珠菌和铜绿假单胞菌通常在临床感染中同时出现，两种微生物的QS系统相互作用，对各自的生长繁殖、毒力因子合成等产生影响[34]。Hogan等[35]发现铜绿假单胞菌QS系统中高丝氨酸内酯可以抑制白色念珠菌中丝状形成但不影响其生长，还发现铜绿假单胞菌能够在丝状白色念珠菌上形成生物膜并杀死细胞，但对酵母态细胞无此作用，这表明白色念珠菌可通过形态转变调控与铜绿假单胞菌的生长竞争关系。相应地，法尼醇可抑制铜绿假单胞菌的喹诺酮信号(Pseudomonasquinolone signal,PQS)合成，进而影响毒力因子绿脓菌素的合成[36-37]。Morita等[38-39]研究发现25 μmol/L的法尼醇可抑制酿酒酵母生长而不影响细胞活力，这种效应与G1细胞周期停滞和细胞内二酰基甘油(DAG)水平的显著降低有关。此外，低浓度法尼醇可抑制Paracoccidioidesbrasiliensis由酵母态向菌丝态的转变[40]，高浓度法尼醇(25～300 μmol/L)能强烈抑制其生长繁殖。法尼醇也可以抑制Mycobacteriumsmegmatis多药物外排泵，降低溴化乙锭和利福平的最小抑菌浓度[41]。

白念珠菌QSMs对多种霉菌生长代谢产生影响。加入法尼醇对构巢曲霉芽管形成无影响，但诱导其凋亡[38]，进一步研究发现构巢曲霉自噬体相关基因ATG8敲除菌对法尼醇更敏感，而蛋白激酶C基因敲除菌的抗性增强，说明法尼醇诱导构巢曲霉细胞凋亡可能依赖于自噬和蛋白激酶C(PkcA)的功能[42]。与构巢曲霉不同，法尼醇对黑曲霉的生长无明显影响，而对其形态转变产生显著影响[43]。法尼醇也能抑制人类病原菌如烟曲霉细胞的生长[44]，可诱导Fusariumgraminearum细胞凋亡并对其分生孢子的形成、发育、萌发及存活产生影响，是潜在的新型抗真菌剂。此外，法尼醇可以抑制Candidadubliniensis菌丝和假菌丝的形成，但对其生长无抑制作用[25]。法尼醇可引起Candidaparapsilosis短暂性生长停滞，生长停滞不限于细胞周期中特定阶段[50]。同时，法尼醇还能抑制C.parapsilosis生物膜的形成，主要通过影响氧化还原酶和甾醇代谢相关基因的表达进行调控[45]。

2 其他真菌的群体感应现象和群体感应分子

除白色念珠菌之外，近些年对其他真菌群体感应现象的研究不断展开，不同真菌中群体感应分子种类和生理效应各有不同。

2.1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

同白色念珠菌一样，酿酒酵母也可以利用群体感应分子进行菌体形态的转变。Chen等[49]研究发现，稳定期的酿酒酵母培养物可以诱导酿酒酵母丝状生长，提取纯化鉴定后发现起作用的群体感应分子是苯乙醇(phenethyl alcohol)和色氨醇(tryptosol)，这两种芳香醇的产生受培养基氮源含量的影响，氮源丰富条件下被抑制，氮源不足时被激活。另外，Severin等[50]研究后提出酿酒酵母凋亡与其群体感应现象有关，酿酒酵母菌体密度会使其基因损伤到达一定的临界值，到达该临界值后，通讯因子交配信息素和氨会诱发细胞凋亡。

2.2 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)

Lee等[51]在研究基因TUP1对新型隐球菌影响时发现，当接种ΔTUP1的接种量小于103时，平板上不能正常形成菌落，而接入ΔTUP1的培养上清液后即使接种量小于103，此菌株也可以生长，他们从该上清液中分离出活性分子QSP1。由于接种量很小，不能生长为菌落即不能称为“群体”，由于该现象与细菌中的群体感应不完全相同，因此把该分子命名为群体效应分子。经鉴定发现这是条分子量为1 136.23的11肽。这种群体感应现象目前只发现在TUP1基因敲除菌中。

2.3 部分真菌的群体感应分子及作用

除上述真菌外，其他一些真菌的群体感应分子及作用如表1所示。如酿酒酵母QSMs已鉴定为苯乙醇、色氨醇，可以调节菌相。类似的还有腐榆角藻菌、辐射松白化菌、黄曲霉等真菌,其QSMs种类虽然不同，但都可以调节菌相。

表1 真菌群体感应分子及作用Table 1 Quorum sensing molecules and effects of in different fungi

3 结论与展望

目前，真菌群体感应系统研究时间不长，其开展的工作主要集中于动植物致病真菌如白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、新型隐球菌、粗糙脉孢菌等，发掘了部分真菌的群体感应分子如白色念珠菌的群体感应分子法尼酸、法尼醇和酪醇，其生理作用有调节自身芽管、菌丝态、酵母态等多种形态之间转变，对生物膜的形成、生物体的氧化应激及其他微生物的生长代谢均具有调控作用。本课题组对能够造成人中心静脉导管(CVC)感染，引起植物的非乙烯依赖性抗性的蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis)进行研究，推测其致病性与群体感应有关，结合其分子性质、细胞胞内代谢特征及其结构式推测该菌的群体感应物质为多元醇类，具体的准确化学结构仍有待后续深入研究。

真菌群体感应系统的分子受体、转录因子、信号传导途径及调控机理仍有待进一步研究。可利用其特点开发新型靶向抗菌药物和针对性技术方法：近年来，在使用抗生素条件下感染多耐药性病原微生物(MDR)的几率增加，不仅严重威胁免疫受损的患者，也变成一个全球性的公共健康危机。由于病原体普遍存在耐药性并且常规药物开发中仍存在缺陷，根除真菌感染非常困难，因此，除了使用现有抗生素，借助新的联合佐剂方法，寻求有效的抗感染治疗策略。在这种情况下，群体感应(QS)在针对高度复杂和进化的真菌细胞间通信现象方面将具有巨大优势。除法尼醇和酪醇外，关于真菌中QSM的信息很少。除QSM以外，真菌还产生次生代谢产物(QSI)，可作为抗微生物剂，可用作特定疾病的广谱抗生素。